Спосіб визначення антигену вірусу імунодефіциту людини

Спосіб визначення антигену вірусу імунодефіциту людини, шляхом з'єднання сироватки крові, яка досліджується із стандартною сироваткою, що містить антитіла до вірусу імунодефіциту людини, який відрізняється тим, що таке з'єднання здійснюють у співвідношенні 10:1, після чого у отриманій біологічній суміші визначають вміст вільних небілкових SH-груп, поява яких вказує на наявність антигену вірусу імунодефіциту людини у сироватці. (19) (21) 97126166 (22) 19.12.1997 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Костюшов Володимир Васильович, Костюшова Лілія Антонівна, Костюшова Наталія Володимирівна, Тимчишин Олег Львович, Мандрієвська Наталья Михайлівна, Морозкін Володимир Васильович (73) Костюшов Володимир Васильович 30086 - з'єднання сироватки крові, що досліджується із стандартною сироваткою, що містить антитіла до ВІЛ у співвідношенні 10:1; - визначення у отриманій біологічній суміші вільних небілкових SH-груп, поява яких вказує на наявність антигену ВІЛ. Запропонована сукупність ознак дозволить виключити несправжньопозитивні та несправжньонегативні результати реакції у способі, що пропонується нами по появі вільних небілкових SH-груп у біологічної суміші: сироватка крові, що досліджується (СК) + стандартна сироватка, що містить антитіла до ВІЛ (СС Ab HIV). Відомий спосіб визначення антигену ВІЛ, шляхом вимірювання оптичної щільності біологічної суміші у ІФА, але не відомий спосіб визначення антигену ВІЛ по появі вільних небілкових SH-гр уп у біологічній суміші: СК + СС Ab HIV. Відомий спосіб визначення вільних небілкових SH-груп у еритроцитах, лейкоцитах, сироватці крові, наприклад, для визначення захворювань крові, інфарктів внутрішніх органів та ін., але невідомо визначення вільних небілкових SH-груп у біологічній суміші: СК + СС Ab HIV. Сутність способу полягає у тому, що з'єднують СК з СС Ab HIV у співвідношенні 10:1, після чого у отриманій біологічній суміші визначають вміст вільних небілкових SH-груп, поява яких вказує на наявність антигену ВІЛ. Для створення оптимального стеохімічного співвідношення між реагуючими центрами антитіл до ВІЛ з антигеном ВІЛ, нами дослідним шляхом обрано співвідношення між СК та СС Ab HIV, яке склало відповідно 10:1. При розробці способу, що пропонується, ми виходили з отриманих нами даних, згідно яких у ВІЛ-інфікованих при з'єднанні їх сироватки крові, що містить антиген ВІЛ, з СС Ab HIV у співвідношенні 10:1, у отриманій біологічній суміші з'являються вільні небілкові SH-групи. Це також підтверджується експериментальними дослідженнями in vitro, згідно яких при з'єднанні стандартної контрольної позитивної сироватки що містить антиген ВІЛ, зі стандартною контрольною позитивною сироваткою, що містить антитіла до ВІЛ у співвідношенні 10:1 у отриманій біологічній суміші з'являються вільні небілкові SH-групи, які свідчать про специфічність біологічної реакції. Окрім того, у експериментальних дослідженнях in vitro встановлено, що у випадку відсутності у реакційній суміші одного з компонентів, вказаної вище біологічної реакції або при додаванні одного з компонентів стандартної контрольної позитивної сироватки, що містить антиген або антитіло іншого інфекційного захворювання (наприклад, антитіла до вірусу гепатиту В, токсоплазмозу, орнітозу та ін., або антигени вірусу гепатиту В, токсоплазмозу, орнітозу та ін.), у такій біологічній суміші завжди відсутні вільні небілкові SH-групи. Нами було встановлено також, що у здорових осіб та у хворих інфекційними та неінфекційними захворюваннями, які не були зумовлені ВІЛ-інфекцією (гострі та хронічні захворювання внутрішніх органів), при з'єднанні їх сироватки крові з СС Ab HIV у співвідношенні 10:1, у отриманій біологічній суміші не з'являються вільні небілкові SH-групи, що свідчить про відсутність антигену ВІЛ у сироватці крови, яка досліджується. Вказане вище з'явилось передумовою для вивчення молекулярних тіолопривних механізмів біологічної реакції антиген-антитіло, тобто сироватки крові, що містить антиген ВІЛ з СС Ab HIV та розробки способу, що пропонується нами. Спосіб, який пропонується нами здійснюється таким чином. У обстежуваного, з дотримуванням правил асептики, здійснюють забір венозної крові у суху стерильну пробірку та доставляють у лабораторне відділення. Одержують сироватку крові загальноприйнятим способом. В СК початково визначають спонтанний вміст вільних небілкових SHгруп методом амперометричного титрування (АМТ), на розробленому нами пристрої для АМТ (патент № 20935 A UA, МКВ А61В10/00, G01N27/26, публ. 07.10.1997). Потім у новий зразок цієї ж СК додають СС Ab HIV у співвідношенні 10:1 та здійснюють термостатування такої біологічної суміші при температурі 37°С, протягом 60 хвилин. Після цього у біологічній суміші досліджують вміст вільних небілкових SH-груп методом АМТ, поява або підвищення вмісту яких вказує на наявність у обстежуваного антигену ВІЛ. При визначенні антигену ВІЛ по способу, що пропонується, нами використовувалась СС Ab HIV з діагностичного набору для скринінгу антигену ВІЛ-1 та ВІЛ-2 Sanofi Pasteur Diagnostic (Франція). Паралельно зі способом, який пропонується проводили дослідження загальноприйнятим способом визначення антитіл до ВІЛ методом ІФА та методом імуноблотингу (таблиця). Аналіз чутливості способу, який пропонується показав, що антиген ВІЛ виявлений у сироватці обстежених хворих ВІЛ-інфекцією, у яких методом ІФА та імуноблотингу також виявлялись антитіла до ВІЛ (таблиця). Нами було обстежено по показаннях 266 осіб. З них донорів - 214 осіб, та по клінічним показникам - 52. У 22 з 266 осіб методом ІФА та імуноблотингу виявлялись антитіла до ВІЛ. Приклади конкретного виконання Приклад 1. У донора Ф-ва, з дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку. Сироватку крові одержували загальноприйнятим способом. В СК початково визначали спонтанний вміст вільних небілкових SH-груп, який склав 0 мкМ/л. Потім, до 900 мкЛ нової порції цієї ж сироватки крові донору додавали 100 мкЛ СС Ab HIV. Здійснювали термостатування такої біологічної суміші при температурі 37°С, протягом 60 хвилин та у біологічній суміші, що досліджується визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 0 мкМ/л, що вказує на відсутність у донора антигену ВІЛ. Паралельно зі способом, який пропонується проводили дослідження загальноприйнятим способом визначення антитіл до ВІЛ методом ІФА та методом імуноблотингу. Антитіла до ВІЛ методом ІФА не були виявлені. Приклад 2. Хворий К-н обстежений у 411 ОВГ по клінічним показанням. З дотримуванням правил асептики, здійснювали забір венозної крові у суху стерильну пробірку. Сироватку крові одержували загальноприйнятим способом. В СК початково ви 2 30086 значали спонтанний вміст вільних небілкових SHгруп, який склав 0 мкМ/л. Потім, до 900 мкЛ нової порції цієї ж сироватки крові хворого додавали 100 мкЛ СС Ab HIV. Здійснювали термостатування такої біологічної суміші при температурі 37°С, протягом 60 хвилин та у біологічної суміші, що досліджується визначали вільні небілкові SH-групи, вміст яких склав 12,3 мкМ/л, що вказує на наявність у хворого К-на антигену ВІЛ. Паралельно зі способом, який пропонується проводили дослідження загальноприйнятим способом визначення антитіл до ВІЛ методом ІФА та методом імуноблотингу. Антитіла до ВІЛ методом ІФА та імуноблотингу також були виявлені. Отримані дані свідчать, що спосіб, що пропонується нами є чутливим, інформативним, має високу діагностичну цінність. Він не вимагає дорогого спеціального устаткування (вертикальний фотометр, промиваючий пристрій), реактивів та ферментів, а також виключає застосування небезпечного для здоров'я канцерогеного субстрату – ортофенілендіаміну. Спосіб, що пропонується значно скорочує час на проведення дослідження, спрощує техніку їх проведення та доступний до широкого застосування у різних медичних установа х. Таблиця Порівняльні дані способу, що пропонується та існуючи х способів Групи обстежених Всього обстежено осіб Донори По клінічним показанням 214 52 Виявлений антиген ВІЛ пропонуємим способом 0 8 3 них виявлені антитіла до ВІЛ Методом імуноМетодом ІФА блотинга 0 0 6 6 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3