Спосіб визначення активності фактору вілібранда

Спосіб визначення активності фактору Вілібранда, що полягає в отриманні бестромбоцитарної плазми, змішуванні бестромбоцитарної плазми з суспензією формалізованих стандартних тромбоцитів, додаванні розчину ристоміцина, проведенні контрольної проби з використанням буферного розтину та визначенні активності фактору Вілібранда за формулою, який відрізняється тим, що в реакцію беруть 60 мкл бестромбоцитарної плазми, 150 мкл суспензії формалізованих стандартних тромбоцитів, 20 мкл розчину ристоміцина, додатково реєструють світлопоглинання реакційних сумішей вертикальним фотометром та вираховують активність фактору Вілібранда за формулою Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики, і може бути використаний для визначення активності фактору Вілібранда у хворих з латолопєю внутрішніх органів Існуючі в НИНІШНІЙ час способи визначення активності фактору Вілібранда - одного з найважливіших маркерів порушень функціонального стану ендотелію судинної стінки, який дозволяє визначати не тільки наявність, але й ступень ендотеліальної дісфункцн у пацієнтів з різноманітними захворюваннями внутрішніх органів, характеризуються оцінкою індукованої агрегації стандартних або формалізованих тромбоцитів під впливом розчину ристоміцину, що пов'язано зі значними методичними труднощами в реєстрації ристомщин-індукованої агрегації Виготовлення розчину індуктора потребує застосування значної КІЛЬКОСТІ реактивів і достатньої точності, від якої залежать показники активності фактору Вілібранда, що реєструються Крім того, обмір калібровочної кривої, за результатами якого і визначається активність фактору Вілібранда, приносить досить значну помилку в отримані результати Тому модифікація існуючих способів визначення активності фактору Вілібранда з метою підвищення точності, достовірності та відтворюваносл результатів дослідження є актуальним питанням сьогодення Відомий спосіб визначення активності фактору Вілібранда, що полягає у наступному 1 Отримують бестромбоцитарну плазму стандартним способом 2 Розводять бестромбоцитарну плазму, яку досліджують, буферним розчином (рН 7,4) у співвідношенні 1 1 3 Готують суміш із 0,04 мл розведеної досліджуваної бестромбоцитарної плазми та 0,04 мл суспензії формалізованих стандартних тромбоцитів 4 На предметному склі за допомогою скляної палички змішують 0,04 мл отриманої суміші та 0,04 мл розчину ристоміцину 5 Відразу після приготування суміші вмикають секундомір і відмічають час з'явлення тромбоцитарних агрегатів у вигляді "снігової бурі" 6 Процес визначення повторюють не менше 2 разів та беруть середні значення часу утворення тромбоцитарних агрегатів 7 Для визначення активності фактору Вілібранда створюють криву розведення, готуючи ряд подвійних розведень суміші бестромбоцитарної плазми здорових осіб у співвідношеннях 1 1 1 2 1 4 1 8 1 16 1 32 За 100% активності приймають час утворення тромбоцитарних агрегатів у плазмі в розведенні плазми 1 1 8 Час утворення тромбоцитарних агрегатів відмічають на осі ординат супротив відповідної концентрації плазми на осі абсцис ФВ= 250.95 де ФВ - активність ФВ в відсотках. Aon - величина світлопоглинання дослідної проби, умовні одиниці, Аісонтр величина світлопоглинання контрольної проби, умовні одиниці. CM ю 6Г 35204 9. З'єднуючи отриманні крапки лінією, малюють калібровочну криву. 10. Визначають активність фактору Вілібранда у бестромбоцитарній плазмі хворого по калібровочній кривій з урахуванням визначення часу утворення тромбоцитарних агрегатів. (Л.П. Папаян Метод определения активности фактора Виллебранда//Лабораторное депо1992.-С. 19-22). Суттєвим ознаками аналогу і винаходу, що збігаються, є такі: 1. Отримання бестромбоцитарної плазми. 2 Змішування бестромбоцитарної плазми з суспензією формалізованих стандартних тромбоцитів. 3. Додавання розчину ристоміцина. 4. Визначення.активності фактору Вілібранда з урахуванням отриманих даних. Не зменшуючи значення вказаного способу, слід помітити, що у вказаних вище умовах агрегація формалізованих стандартних тромбоцитів залежить перед усім від вмісту в реакційній суміші ристоміцину, (яка важко стандартизується, оскільки не визначена чітка кількість розчину ристоміцину, що додається до реакційної' суміші) та активності фактору Вілібранда. Крім того реєстрація часу утворення тромбоцитарних агрегатів, який є показником, за котрим визначається активність фактору Вілібранда в описаному способі, не має чіткого фізіологічного та (або) патофізіологічного обгрунтування - процес агрегації проходить декілька етапів з утворенням мікроагрегатів, не помітних неозброєним оком, з наступним їх збільшенням, коли вони стають помітними, але процес на цьому не зупиняється, а продовжується далі. Тому реєстрація часу утворення агрегатів, які стають помітними неозброєним оком, менш адекватна в зрівнянні з оцінкою ступеня агрегації за визначений (стандартний) проміжок часу, тому що час утворення великих агрегатів пов'язаний з впливом багатьох факторів: сумарний вміст білків в реакційної суміші, що привносяться в складі досліджуваємої плазми, температура зовнішнього середовища, характер та інтенсивність перемішування реакційної суміші й ін. Таким чином, при визначенні активності фактору Вілібранда зазначеним способом значно страждають точність, достовірність і відтворюванність результатів дослідження, на що вказують і самі автори способу, пропонуючи проводити визначення активності фактору Вілібранда неодноразово, використовуючи декілька разів той самий зразок бестромбоцитарної плазми досліджуваного. Найбільш близьким за технічною суттєвістю та досягаємим результатом є спосіб визначення активності фактору .Вілібранда, що полягає в наступному: 1. Отримують бестромбоцитарну плазму стандартним способом. 2. 0,1 мл бестромбоцитарної плазми змішують з 0,1 мл суспензії формалізованих стандартних тромбоцитів. 3. Додають 1,8 мл розчину ристоміцину. 4. Перемішують протягом 10 хвилин. 5. Центрифугують 2 хвилини при 1500 оборотів за хвилину для зсідання тромбоцитарних аг' регатів. 6. Із середнього слою отриманих супернатантів підраховують кількість одиничних тромбоцитів. 7. Паралельно проводять контрольну пробу з використанням буферного розчину замість бестромбоцитарної плазми. 8. Вираховують активність фактору Вілібранда за формулою. де у = А-В, в свою чергу де: А • кількість одиничних тромбоцитів в контрольній пробі, В - кількість одиничних тромбоцитів в опитній пробі. (АН. Лившиц. Микрометод определения фактора Виллибранда в плазме крови // Лабораторное дело.-1991 .- № 5.-С. 24-26). Спільними істотними ознаками прототипу і способу, що заявляється, є: 1. Отримання бестромбоцитарної плазми. 2. Змішування бестромбоцитарної плазми з суспензією формалізованих стандартних тромбоцитів. 3. Додавання розчину ристоміцина. 4. Проведення контрольної проби з використанням буферного розчину замість бестромбоцитарної плазми. 5. Визначення активності фактору Вілібранда за формулою. Варто зауважити, що визначення активності фактору Віпібранда у розглянутому способі здійснюється непрямим шляхом, так як фактор Вілібранда викликає агрегацію тромбоцитів, тому для визначення його активності необхідна реєстрація саме процесу агрегації, а автори пропонують проводити визначення активності фактору Вілібранда виходячи з кількості стандартних формалінізова* них тромбоцитів, не залучених до реакції, що значно погіршує точність і тим більше відтворюванність результатів дослідження. Крім того, запропонований спосіб підрахунку кількості тоомбоцитів, що не вступили в реакцію агрегації, від якої безпосередньо залежить активність фактора Вілібранда, яка визначається, украй суб'єктивний, тому що передбачає використання візуальної оцінки результатів. Значно погіршує достовірність результатів дослідження активності фактора Вілібранда при її визначенні відповідно до зазначеного способу й те, що вертикальний розподіл одиночних тромбоцитів і їх агрегатів різного розміру дуже індивідуально, тому відсутність стандартизованого способу відбору фракції супернатанта, в якій проводиться визначення числа одиночних тромбоцитів, може привести до різкого заниження числа одиночних тромбоцитів у випадку, якщо відбір буде зроблений із шару, де переважно містяться тромбоцитарні агрегати. Таким чином, незважаючи на те, що існує принципова можливість визначення активності фактора Вілібранда вищевказаним способом, при розгляді абсолютних величин його активності виникає велике число труднощів через незначну точність, достовірність та відтворюванність результатів дослідження.' В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу визначення активності фактору Вілібранда шляхом зміни кількості використовує 35204 мих компонентів реакційної суміші, метода реєстрації результатів реакції агрегації, що дозволить підвищити точність, достовірність та відтворюванність результатів дослідження. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення активності фактору Вілібранда, що полягає в отриманні бестромбоцитарної плазми, змішуванні бестромбоцитарно'і плазми з суспензією формалізованих стандартних тромбоцитів, додаванні розчину ристоміцина, проведенні контрольної проби з використанням буферного розчину замість бестромбоцитарної плазми та визначенні активності фактору Вілібранда за формулою, новим є те, що в реакцію беруть 60 мкл бестромбоцитарної плазми, 150 мкл суспензії формалізованих стандартних тромбоцитів, 20 мкл розчину ристоміцина, додатково реєструють світлопоглинання реакційних сумішей вертикальним фотометром та вираховують активність фактору Вілібранда за формулою: Ф В = 2 5 0 . 9 5 х(Аоо 1 і9в де ФВ - активність ФВ в відсотках, Aon - величина світлопоглинання дослідної проби, умовні одиниці, Акомтр - величина світлопоглинання контрольної проби, умовні одиниці. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному: тромбоцити здорових осіб, оброблені формаліном, втрачають здатність до спонтанної агрегації, та можуть агрегувати тільки в присутності фактору Вілібранда під впливом ристоміцину. При цьому глікопротеід ристоміцин викликає конформаційну перебудову рецепторів тромбоцитів, в результаті чого звільняються їх активні центри, з якими зв'язуються молекули фактору Вілібранда, виступаючи своєрідним «містком» між тромбоцитами, що в кінцевому випадку і обумовлює агрегації тромбоцитів. Таким чином, у вказаних умовах ступінь агрегації тромбоцитів буде кількісно залежати від присутності у реакційному середовищі фактору Вілібранда. Не зважаючи на те, що концентрація активуючого агенту • ристоміцину здійснює деякий вплив на процес агрегації, в пропонуємому способі цей вплив зведений до мінімуму, так як графік залежності ступеня агрегації тромбоцитів від концентрації ристоміцину, при інших рівних умовах, має S-подібну форму з вираженим плато, на яке й приходиться використовуєма концентрація ристоміцину. Таким чином, ступінь агрегації тромбоцитів у запропонованому способі залежить виключно від концентрації в реакційному середовищі фактору Вілібранда, що дозволяє значно зменшити кількість компонентів, необхідних для створення реакційного середовища та підвищує достовірність і точність результатів дослідження. Використання вертикального фотометру, яке дозволяє реєструвати оптичну густину усієї реакційної суміші, а не тільки її частини, як у прототипі, також сприяє зменшенню об'ємів реакційної суміші та, крім того, значно підвищує відтворюванність результатів дослідження. Визначення активності фактору Вілібранда за допомогою алгебраїчного рівняння дозволяє суттєво зменшити помилку, пов'язану з обміром калібро вочної кривої, що в свою чергу підвищує точність визначень. Вищезазначене рівняння найбільш точно та адекватно описує залежність між значенням світлопоглинання та активність фактору Вілібранда, тому що воно відібрано шляхом аналізу лінійної, логарифмічної, ступеневої та експоненціальної моделей. Вибір рівняння проводили за допомогою узагальненого критерію якості, який вираховувався як зважена сума критерію точності та критерію адекватності. Вага зазначених складових складала відповідно 0,75 та 0,25, таким чином точностним характеристикам надавали більшу вагу. В якості критерію точності використовували нормоване значення середньої відносної помилки апроксимації, а в якості критерію адекватності - нормоване значення критерію Darbin-Wothson. Числове значення узагальненого критерію якості знаходилось у діапазоні від 0 до 100, мінімальне значення відповідало абсолютно поганій моделі, максимальне - ідеальній моделі. Узагальнений критерій якості для запропонованого рівняння був найбільшим серед досліджених моделей і склав 87,8, що свідчило про достатньо повну відповідність розрахованих та експериментальних величин. Таким чином, використання запропонованого способу визначення активності фактору Вілібранда значно підвищує точність, вірогідність та відтворюванність результатів дослідження. Для визначення показника норми було обстежено 128 чоловік, з них 43 практично здорових осіб, 53 хворих на гіпертонічну хворобу, 32 хворих з постінфарктним кардіосклерозом. Серед обстежених здорових осіб були представлені різні вікові групи (згідно рекомендацій ВООЗ), середній вік склав 41,4±12,3 року, жінок було 18 (41,86%), чоловіків - 25 (58,14%). Після обчислення результатів обстеження групи здорових осіб активність фактора Вілібранда склала 108,14±8,36%. Спосіб здійснюється слідуючим чином: 1. Шляхом венепункції набирають у сіліконізований шприц декілька мілілітрів крові. 2. Змішують кров з антикоагулянтом - 4% розчином цитрату натрію у співвідношенні 1:4. 3. Центрифугують отриману суміш 5 хвилин при 1500 обертах за хвилину. 4. В чисту суху центрифужну пробірку відбирають супернатант. 5. Отриманий супернатант центрифугують 20 хвилин при 4000 обертах за хвилину. 6. Паралельно здійснюють контрольну пробу, де замість бестромбоцитарної плазми використовують буферний розчин. 7. В кожну лунку плоскодонного пластикового планшету вносять по 60 мкл буфера Мі-хаеліса (РН 7,4). 8. Додають до отриманої суміші 150 мкл суспензії стандартних формалізованих тромбоцитів. 9. Змішують отриману суміш та 60 мкл досліджуємої бестромбоцитарної плазми. 10. В дослідну пробу додають 20 мкл розчину ристоміцину в концентрації 10 мг/мл, приготовленого безпосередньо перед дослідженням. 11. В контрольну пробу додають 2 0 мкл буферного розчину. 12. Величину світлопоглинання дослідної та контрольної проби визначають через 2 хвилини за допомогою вертикального планшетного фотометру при світлофільтрі 540 нм. 35204 13. Активність фактору Вілібранда визначають за формулою: 250.95 де ФВ - активність ФВ в відсотках, Aon - величина світлопоглинання дослідної проби, умовні одиниці, Приклад: Хворій С. 43 років надійшов в кардіологічне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні з скаргами на запаморочення, головний біль, «мільтішиння цяток» перед очами, дзвін в вухах, задишку при фізичному навантаженні. Вважає себе хворим протягом 8 років, коли вперше, без видимої причини, було зареєстровано носову кровотечу, яка супроводжувалася підвищенням артеріального тиску до 190 та 120 мм рт. ст. Згодом хворий неодноразово знаходився на стаціонарному лікуванні з приводу гіпертонічної хвороби, одержував амбулаторну терапію р-блокаторами і діуретинами. За тиждень до надходження в клініку, після сильного лсіхоемоційного потрясіння, з'явилися вищезазначені скарги на тлі високих цифр артеріального тиску (до 180 і 110 мм рт.ст.), і хворий був госпіталізований для купіровання гіпертонічного криза та корекції проводимо'! терапії. Анамнез життя - без особливостей, мати хворого страждала гіпертонічною хворобою, іншої спадкової патології в родині не виявлено. Пацієнт палить протягом 13 років, інші шкідливі звички заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений. Об'єктивно спостерігаються наступні зміни. Артеріальний тиск в момент надходження 180 і 100 мм рт. ст. на лівій і 185 і 110 мм рт. ст. на правій плечових артеріях, пульс 84 ударів в хвилину, задовільних властивостей При пальпації верхівний поштовх визначається на 2-2,5 см зовні від середньоключичної лінії з лівої сторони в 6 міжребірьї, поширений, збільшений по висоті, посилений. Перкуторно - розширення границь відносної серцевої тупості, аускультативно - діяльність серця правильна, посилений І тон на верхівці серця, в легенях дихання везикулярне, жорсткувате, в нижніх відділах з обох сторін одиничні вологі дрібнобулькасті неконсонуючі хрипи Частота дихання 20 в 1 хвилину, дихання по верхневе. На електрокардіограмі • ознаки гіпертрофії міокарда лівого шлуночка, порушення процесів реполярізації в лівих грудних відведеннях. При ехокардіографічному дослідженні спостерігається збільшення кінцеводіастолічного і кінцевосістолічного об'ємів лівого шлуночка, помірне зниження його скорочувальних властивостей, потовщення задньої стінки лівого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, наявна гіпертрофія міокарда лівого шлуночка (індекс маси міокарда лівого шлуночка 3 123 г/м ). При рентгенологічному дослідженні в легенях посилений судинний малюнок, корені структурні, тяжисті, більше з правої сторони. При дослідженні очного дна визначається звуження і склерозування артерій, вени повнокровні, поширені, феномен Салюса-Гуна ІІ-ІІІ ступеня. Дані інших інструментальних та лабораторних досліджень без особливостей. Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження і зважаючи на результати додаткових способів дослідження, хворому був поставлений клінічний діагноз - гіпертонічна хвороба, II стадія. Враховуючи часту асоціацію порушення функції ендотелію з підвищенням артеріального тиску та з метою оптимізації застосовуємо протигіпертензивної терапії, у хворого була визначена активність фактору Вілібранда згідно пропонуємому способу, яка склала 168,23%. Через 12 тижнів комплексного лікування, яке включало додаткове застосування лікарських засобів, які мають ендотелій-протекторні властивості, при контрольному обстеженні поряд з поліпшенням клінічної картини захворювання та позитивною динамікою даних інструментальних досліджень, спостерігалося достовірне зменшення активності фактора Вілібранда, яка на кінець курсу терапії склала 129,34%. Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволило вчасно визначити ступінь залученості ендотеліапьних клітин в патологічне коло патофізіологічних ланок захворювання шляхом визначення активності фактора Вілібранда, призначити патогенетично зумовлену терапію, що в підсумку призвело до підвищення якості діагностики, дозволило оптимізувати лікування і відвернути появу ускладнень. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 ( 0 3 1 2 2 ) 2 - 5 7 - 0 3