Спосіб виготовлення субстрату тканинного антигену

Спосіб виготовлення субстрату тканинного антигену, що включає дезінтеграцію біологічної тканини за допомогою обробки її фізичними чинниками, який відрізняється тим, що тканинну субстанцію попередньо піддають кріогенній обробці з наступною ліофілізацією, після чого подрібнюють до дрібнодисперсного стану, зокрема, з розміром частинок в межах від 0,1 до 1,0 мм включно, та фасують у стерильні флакони або пакети. (19) (21) u200806245 (22) 12.05.2008 (24) 10.10.2008 (46) 10.10.2008, Бюл.№ 19, 2008 р. (72) ДЕМ'ЯНЕНКО ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ, UA, П'ЯТНИЦЬКИЙ ЮРІЙ СЕРГІЙОВИЧ, UA, ГУДА НАТАЛЯ ВОЛОДИМИРІВН А, U A, ЛУЧАНКО ПЕТРО ІВАНОВИЧ, UA, ЛОЗА ЛЮДМИЛА СТАНІСЛАВІВНА, UA (73) ІНСТИТУТ БІОМЕДИЧНИХ ТЕХНОЛОГІЙ, UA 3 36019 багатьох компонентів живих тканин, серед яких ліпідам мембран та нуклеїновим кислотам клітин належить провідна роль [2, 3], при наднизькій температурі особливо проявляються зрушення в біомакромолекулах з рідкокристалічними властивостями. Не останню роль при цьому відіграють зміни електретних і діелектричних властивостей кріоконсервованих тканин, тунельні процеси в їх макромолекулярних компонентах [4-8]. До того ж, набута в результаті ліофільної сушки твердість субстанції попередньо кріоконсервованих тканин забезпечує можливість їх контрольованого подрібнення, що забезпечує, по-перше, можливість доведення отриманого біосубстрату до необхідного рівня дисперсності, а, по-друге, можливість довготривалого збереження. Останнє стає підосновою промислового отримання великої кількості (при необхідності - від однієї особини) стандартизованого, що піддається періодичному контролю тканинного антигену для використання за призначенням. Виходячи з наведеного, у відомому способі виготовлення субстрату тканинного антигену, що включає дезінтеграцію біологічної тканини за допомогою обробки її фізичними чинниками, відповідно до корисної моделі тканинну субстанцію попередньо піддають кріогенній обробці з наступною ліофілізацією, після чого подрібнюють до дрібнодисперсного стану, зокрема, з розміром частинок в межах від 0,1 до 1,0 мм включно, та фасують у стерильні флакони або пакети. Перелік фігур. Фіг. 1. Подрібнена кріоконсервована і ліофілізована шкіра свині - напівфабрикат субстрату тканинного антигену для виготовлення дермального антигену. Фіг. 2. Поляризаційна флуоресценція дрібної частинки шкіри свині. Фіг. 3. Спектральний склад флуоресцентного світіння мікрочастинки субстрату тканинного антигену (1) і цільного клаптя (2) консервованої шкіри свині. Фіг. 4. Поляризаційна флуоресценція мікрочастинок субстрату тканинного антигену з подрібненої шкіри свині. Фіг. 5. Зовнішній вигляд кріоконсервованої і ліофілізованої тканини рогівки ока свині як напівфабрикат тканинного антигену. Фіг. 6. Антиген з кріоконсервованих і ліофілізованих відмитих мембран еритроцитів. Фіг. 7. Порошковий субстрат тканинного антигену з кріоконсервованої і ліофілізованої плаценти. Фіг. 8. Порошковий субстрат тканинного антигену плаценти у герметично закатаному флаконі. Спосіб здійснюють у такий спосіб. Взяту для переробки на тканинний антиген свіжу тканину розрізають на клаптики і промивають послідовно водою та ізотонічним розчином хлориду натрію, потім закладають у касети і піддають кріогенній обробці в парах азоту впродовж двох годин, після чого здійснюють ліофільну сушку. Висушену субстанцію подрібнюють до певного рівня дисперсності, наприклад, з розміром частинок від 0,1 до 1,0 мм включно, а готовий продукт - суб 4 страт тканинного антигену у вигляді подрібненої субстанції фасують у стерильні флакони або пакети. Перед фасуванням проводять стандартизацію продукту за розміром мікрочастинок, за вмістом білка, за біофізичними параметрами, зокрема, спектральним складом поляризаційної флуоресценції, та іншими біологічними та імунобіологічними показниками. Приклад 1. Із шкіри свині готували тканинний субстрат за технологією виробництва ксенодермотрансплантату, якою передбачено етапи кріоконсервування при температурі рідкого азоту з наступною ліофілізацією [5]. Висушені ліофільним способом клапті ксеношкіри подрібнювали до дрібнодисперсного стану, зокрема, з розміром мікрочастинок в межах від 0,1 до 1,0 мм включно (фіг.1) та досліджували за методикою поляризаційної флуоресценції (фіг. 2), у тому числі - з визначенням спектрального складу флуоресцентного світіння. При дотриманні вимог технологічного процесу частинкам ксеношкіри притаманна двохпікова спектральна крива: лівий пік відповідає спектру ДНК, а правий, з більшою довжиною хвилі - РНК (фіг. 3). Водна суспензія подрібненого субстрату ксеношкіри відзначається своєрідною картиною флуоресценції мікрочастинок (фіг. 4), за характером якої можна робити висновок про їх фізичні властивості. Далі подрібнений субстрат консервованої шкіри свині змішали з ізотонічним розчином натрію хлориду в співвідношенні 1:5 і витримували упродовж 24 год при 4°С для екстрагування білків. Після цього гомогенат відцентрифугували при 3000 об/хв упродовж 20 хв, а отриманий надосад профільтрували за допомогою фільтра Зейтца. Загальний вміст білка в надосаді довели до 5 мкг/л. Аналогічним чином готували тканинний субстрат для подальшого отримання антигену з тканини рогівки ока, зокрема, свині (фіг. 5), з відмитих еритроцитів крові донорів - для отримання антигену еритроцитарних мембран (фіг. 6), а також з тканини нативної плаценти (фіг. 7 і 8). Приклад 2. Виготовлені за наведеною технологією тканинні антигени випробовували в реакціях імунологічного конфлікту in vitro та in vivo. При цьому отримані шляхом імунізації лабораторних тварин гетероімунні сироватки містили антитіла до відповідних антигенів, а отже - органів і тканин, з яких, власне, й були виготовлені антигени. Так, перебіг цитотоксичного набряку легень у білих щурів при введенні їм гетероімунної антипульмональної сироватки кролика, отриманої шляхом імунізації останнього антигеном з легеневої тканини, виготовленого за запропонованим способом, не відрізнявся від аналогічного патологічного процесу, індукованого введенням сироватки, яку отримали імунізацією кролика традиційно виготовленим антигеном. Ідентичними виявилися у піддослідних тварин лейкоцитотоксичні реакції in vitro у вигляді лейкоаглютинації і лейкоцитолізу. Не відрізнявся характер мембранної резистентності еритроцитів у тестових пробах кислотного гемолізу при навантаженні останніх комплексами антиген 5 36019 антитіло, сформованими внаслідок імунного конфлікту на моделях in vi vo та in vitro. Таким чином, виготовлення субстрату тканинного антигену за запропонованим способом забезпечує значно вищий, порівняно із способомпрототипом, рівень технологічності. Довготривале збереження субстрату антигену як висушеного ліофільним способом тканинного продукту, забезпечує його довготривале використання за потребою, чим суттєво підвищується точність і відтворюваність результатів дослідження, зокрема у виробництві біологічних матеріалів, наприклад, імунних сироваток, в експериментальній медицині, а також в практиці клініко-діагностичних досліджень. Джерела інформації, які слід взяти до уваги: 1. Кишев М.Г. Анти генные свойства отдельных слоев стенки сосудов человека (при атеросклерозе). - Бюлл. эксперм. биол., 1970, т. 10. - С. 74-77. 2. Антонов В.Ф., Смирнова Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны при фазовых превращениях. М.: Наука, 1992. 3. Жидкие кристаллы вчера, сегодня и завтра. Бюллетень Жидкокристаллического общества «Содружество». - 1998. - Вып.7. - С. 45. 6 4. Ковальчук О.Л, Демьяненко В.В., Гуда Н.В. Багатофакторне забезпечення загоєння ран і гнійно-некротичних процесів за допомогою апарату "Амфора" // Клін. хірургія. № 11-12 (741-742). 2004. - С. 42-43. 5. Бігуняк В.В., Дем'яненко В.В., Бігуняк Н.В. Біологічні і біофізичні властивості ліофілізованої шкіри свині: загальнобіологічні аспекти, проблеми, перспективи / Матеріали XX з'їзду хірургів України. Тернопіль: Укрмедкнига, 2002, - т. 2. - С. 649-651. 6. Дем'яненко В.В., Гудима А.А. Асиметрія поляризаційної флуоресценції ядерної ДНК лейкоцитів як прояв її анізотропії // Здобутки клінічної та експериментальної медицини. К: Укрмедкнига. - 2006, № 1. - С. 38-41. 7. Электреты / Пер. с англ. под ред. Г. Сесслера. М.: Мир, 1983. - 487 с. 8. Бігуняк В.В., Дем'яненко В.В., Гуда Н.В. Можливості використання субстрату консервованої ксеногенної шкіри: проблеми і перспективи // Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів // Матеріали ІІ-ї міжнародної науково-практичної конференції. Тернопіль: Укрмедкнига, 2007. - С. 34-36. 7 Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 36019 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601