Спосіб визначення стану активності кислої фосфатази лімфоцитів

Спосіб визначення стану активності кислої фосфа тази лімфоцитів, що включає реєстрацію дати дослідження, забір капілярної крові, приготування мазка, його швидке висушування, інкубацію мазка з субстратно-буферною сумішшю нафтолАз-фосфату, промивання ізотонічним розчином хлориду натрію, дофарбовування фарбником Романовського-Гімзи, промивання в проточній воді, висушування мазка і його мікроскопування; визна 3 36285 Недоліком даного способу є неврахування показника активності КФл, який відображує активність ферменту в різні пори року, що призводить до некоректної оцінки результатів дослідження. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - забір капілярної крові; - приготування мазка; - швидке висушування мазка; - інкубація мазка з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього з наступним витримуванням мазка в термостаті при 37°С протягом 2 годин; - промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; - дофарбовування протягом 15хв. фарбником Романовського-Гімзи; - промивання в проточній воді протягом 10с.; - висушування; - мікроскопування; - виявлення активності ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; - підрахунок активності КФл в умовних одиницях за Астальді-Верга у 100 лімфоцитах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми; - порівняння отриманих даних з даними контролю і висновок за цим показником про стан активності кислої фосфатази лімфоцитів у пацієнта. Відомий спосіб оцінки стану активності КФл за параметрами її річного біоритму [Н.В. Колесник, Н.Г. Баранник, Ю.А. Кривохацкая, Г.Б. Стерн, Н.Б. Широколобова. Параметры годовых ритмов активности ферментов лейкоцитов практически здоровых лиц //Тезисы докладов научно-практической конференции врачей г. Запорожье, посвященной памяти выдающихся медиков-рационализаторов В.В. Ярошенко и Я.Р. Гасуля. Запорожье. -1994. 156с. -С.95-97], який включає реєстрацію місяця і години забору капілярної крові; приготування мазка; його швидке висушування; інкубацію мазка з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Азфосфа ту, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазолю синього з наступним витримуванням мазка в термостаті при 37°С протягом 2 годин; промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; до фарбовування фарбником Романовського-Гімзи; промивання в проточній воді; висушування; мікроскопування; визначення активності КФл, порівняння даних зі середньорічним значенням цього показника в популяції, який приймають за норму, а амплітуду річного коливання - за верхню і нижню межі норми, і за цим показником роблять висновок про стан активності кислої фосфатази. 4 Недоліком даного способу є неможливість порівняння активності КФл досліджуваного зразка крові з такою, яка відповідає місяцю дослідження, що обумовлює некоректну оцінку результатів дослідження. Спільними з прототипом ознаками є: - реєстрація дати дослідження; - забір капілярної крові; - приготування мазка; - швидке висушування мазка; - інкубація мазка з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазолю синього з наступним витримуванням мазка в термостаті при 37°С протягом 2 годин; - промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; - дофарбовування 15хв. фарбником Романовського-Гімзи; - промивання в проточній воді протягом 10с.; - висушування; - мікроскопування; - виявлення активності ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; - підрахунок активності КФл в умовних одиницях за Астальді-Верга у 100 лімфоцитах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми; - порівняння отриманих даних з показником цього ферменту в популяції і висновок за цим показником про стан активності кислої фосфатази у пацієнта. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення стану активності кислої фосфатази лімфоцитів, який шляхом цитохімічної реакції і врахування залежності активності ферменту від місяця року, дозволяє здійснити експрес-оцінку стану активності КФл в обстежуваної особи, підвищити її точність і коректність. Суттєвими ознаками способу є: - реєстрація дати дослідження; - забір крові; - приготування мазка; - швидке висушування його на повітрі; - інкубація мазка з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину хлориду магнію; 50мг діазолю синього (суміш готують і фільтрують перед використанням), після чого мазок витримують у термостаті при 37°С протягом 2 годин; - промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; - дофарбовування фарбником РомановськогоГімзи; - промивання в проточній воді; - висушування; - мікроскопування; 5 36285 - визначення активності ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; - підрахунок у 100 лімфоцитах активності КФл в умовних одиницях за Астальді-Верга залежно від ступеня забарвлення цитоплазми; - розрахунок відносної активності КФлвідн. у досліджуваної особи за формулою: КФлп КФлвідн. = ´ 100% , (1) 41 9 + 11х , , де КФлвідн. - відносна активність КФл в обстежуваної особи, %; КФлп - активність КФл в обстежуваної особи, у.о.; 41,9 - постійний коефіцієнт активності ферменту в популяції на протягом року, у.о.; 1,1 - постійний коефіцієнт місяця, у.о.; х - порядковий номер місяця року; - визначення за цим показником стану активності кислої фосфатази лімфоцитів у пацієнта. Відмінними від прототипу ознаками є визначення відносної активності кислої фосфатази лімфоцитів за формулою 1 шляхом порівняння результатів активності ферменту КФл пацієнта зі значеннями активності ферменту в популяції у конкретний місяць року та оцінка за цим показником стану активності кислої фосфатази лімфоцитів у пацієнта. Спосіб обґрунтовано щомісячними дослідженнями протягом трьох років (394 особи) активності ферменту в мазках периферичної крові позаштатних донорів з діагнозом «здоровий» і відсутністю змін у лейкоцитарній формулі. Досліджували кров, яку відбирали між 9 і 10 годинами ранку, го тували мазки, швидко висушували їх, наносили на нефіксовані мазки по 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазолю синього, суміш готували і фільтрували перед використанням; мазки інкубували в термостаті при 37°С протягом 2 годин; промивали ізотонічним розчином хлориду натрію; дофарбовували 15хв. фарбником Романовського-Гімзи; промивали в проточній воді протягом 10с.; висушували і мікроскопували; активність ферменту виявляли за інтенсивністю дифузно-гранулярного синього фарбування цитоплазми у 100 лімфоцитах, яку виражали в умовних одиницях залежно від ступеня забарвлення цитоплазми, для чого досліджувані лімфоцити розподіляли на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++). Статистичний аналіз отриманої бази даних здійснювали за допомогою ППП Statistica 7, модулів «Множинна регресія», «Факторний аналіз», «Часові ряди» і «Графічний аналіз». Активність ферменту в практично здорових осіб не залежить від віку і статі. На основі статистичного аналізу бази даних було встановлено залежність активності кислої фосфатази від місяця року, що зображується рівнянням: КФлм =41,9+1,1х, (2) де: 6 КФлм - активність кислої фосфатази лімфоцитів, що відповідає конкретному місяцю року, у.о.; 41,9 - постійний коефіцієнт активності ферменту в популяції протягом року, у.о.; 1,1 - постійний коефіцієнт впливу місяця року на активність КФл; х - порядковий номер місяця року; 95% довірчий інтервал дорівнює ±5,5у.о. Спосіб здійснюють таким чином: реєструють дату дослідження, проводять забір капілярної крові; готують мазок; виконують його швидке висушування; інкубують мазок з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину хлориду магнію; 50мг діазолю синього (суміш готують і фільтрують перед використанням), після чого мазок витримують у термостаті при 37±1°С протягом 2±0,05 годин; промивають ізотонічним розчином хлориду натрію; дофарбовують фарбником Романовського-Гімзи; промивають у проточній воді не довше 10с.; висушують при кімнатній температурі; мікроскопують, у 100 лімфоцитах проводять підрахунок активності КФлп в умовних одиницях за Астальді - Верга, для чого залежно від ступеня забарвлення цитоплазми досліджувані лімфоцити розподіляють на 4 групи: з негативною реакцією (–), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); далі число лімфоцитів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножують на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складає умовні одиниці (у.о.); визначають відносну активність КФлвідн. за формулою 1, і за цим показником роблять висновок про стан активності кислої фосфатази лімфоцитів пацієнта і при значенні показника у діапазоні 100±15 діагностують норму. Приклад конкретного виконання. Пацієнтка К., вік - 29 років. Діагноз - вагітність 31 тиждень, загроза переривання вагітності. Дата дослідження активності КФл - 19 лютого 2007р. Здійснювали забір капілярної крові, готували мазок, швидко висушували його на повітрі, інкубували мазок з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого заливали нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містило 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазолю синього (суміш готували і фільтрували перед використанням), після чого мазок витримували в термостаті при 37°С протягом 2 годин, промивали ізотонічним розчином хлориду натрію, дофарбовували фарбником Романовського-Гімзи, промивали в проточній воді, висушували, мікроскопували; визначали активність ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; у 100 лімфоцитах підраховували активність КФл в умовних одиницях за Астальді-Верга. Активність ферменту вагітної жінки складала 50у.о. 7 36285 Розраховували відносну активність КФлвідн у пацієнтки за формулою 1: КФлвідн. = 50 ´ 100 % = 113,3 41,9 + 1,1х 2 Значення активності кислої фосфатази в пацієнтки практично дорівнює показнику норми в лютому. Отриманий результат свідчить про те, що адаптивна клітинна ланка імунної системи у жінок з загрозою переривання вагітності не активована. Пацієнт Т., вік - 23 років. Діагноз - загострення лівобічного хронічного мезотімпаніту. Дата дослідження активності КФл - 12 грудня 2006р. Здійснювали забір капілярної крові, готували мазок, швидко висушували його на повітрі, інкубували мазок з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого заливали нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містило 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміду; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазолю синього (суміш готували і фільтрували перед використанням), після чого мазок витримували в термостаті при 37°С протягом 2 годин, промивали ізотонічним розчином хлориду натрію, дофарбовували фарб Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 8 ником Романовського-Гімзи, промивали в проточній воді, висушували, мікроскопували; визначали активність ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; у 100 лімфоцитах підраховували активність КФл в умовних одиницях за Астальді-Верга. Активність КФл хворого складала 86у.о. Розраховували відносну активність КФлвідн. у пацієнта за формулою: 86 КФлвідн. = ´ 100 = 156,1% 419 + 11х12 , , Отже, рівень активності КФл при загостренні хронічного мезотімпаніту на 56% вище за показники норми грудня, що свідчить про наявність антигенної стимуляції адаптивної ланки імунного захисту у хворих із хронічними захворюваннями. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє проводити експрес-оцінку стану метаболічної активності лімфоцитів - клітин, що забезпечують функціонування адаптивної ланки імунної системи, з урахуванням стану активності кислої фосфатази лімфоцитів у популяції в місяць дослідження, що сприяє коректному оцінюванню порядковий номер місяць року результатів аналізу пацієнта та обумовлює призначення адекватної терапії. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601