Спосіб визначення стану активності кислої фосфатази нейтрофілів

Спосіб оцінки стану активності кислої фосфа тази нейтрофілів, що включає реєстрацію дати дослідження, забір капілярної крові, приготування мазка, його швидке висушування, інкубацію мазка з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, промивання ізотонічним розчином хлориду натрію, дофарбовування фарбником Романовського-Гімзи, промивання в проточній воді, висушування мазка і його мікроскопування; визначення активності ферменту 3 30459 Недоліком даного способу є неврахування показника активності КФн, який відображує активність ферменту в різні пори року, що обумовлює некоректну оцінку результатів дослідження. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - забір капілярної крові; - приготування мазка; - швидке висушування мазка; - нкубація мазка з субстратно - буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину ОД М хлориду магнію; 50мг діазоля синього з наступним витримуванням мазка в термостаті при 37°С протягом 2 годин; - промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; - дофарбовування протягом 15хв. фарбником Романовського-Гімзи; - промивання в проточній воді протягом 10с; - висушування; - мікроскопування; виявлення активності ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; - підрахунок активності КФн в умовних одиницях за Астальді Верга у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми; - порівняння отриманих даних з даними контролю і висновок за цим показником про стан активності кислої фосфатази в пацієнта. Відомий спосіб оцінки стану активності КФн за параметрами її річного біоритму [Н.В. Колесник, Н.Г. Баранник, Ю.А. Кривохацкая, Г.Б Стерн, Н.Б. Широколобова. Параметры годовых ритмов активности ферментов лейкоцитов практически здоровых лиц// Тезисы докладов научнопрактической конференции врачей г. Запорожье, посвященной памяти выдающихся медиков рационализаторов В.В. Ярошенко и Я.Р. Гасуля. Запорожье. - 1994. - 156с. - С.95-97], який включає реєстрацію місяця і години забору капілярної крові; приготування мазка; його швидке висушування; інкубація мазка з субстратно буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього з наступним витримуванням мазка в термостаті при 37°С протягом 2 годин; промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; дофарбовування фарбником РомановськогоГімзи; промивання в проточній воді; висушування; мікроскопування; визначення активності КФн, порівняння даних зі середньорічним значенням цього показника в популяції, який приймають за норму, а амплітуду річного коливання - за верхню і нижню межі норми, і за цим показником роблять висновок про стан активності кислої фосфа тази. 4 Недоліком даного способу є неможливість порівняння активності КФн досліджуваного зразка крові з такою, яка відповідає місяцю дослідження, що обумовлює некоректну оцінку результатів дослідження. Спільними з протопипом ознаками є: - реєстрація дати дослідження; - забір капілярної крові; - приготування мазка; - швидке висушування мазка; - інкубація мазка з субстратно - буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить Юмг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього з наступним витримуванням мазка в термостаті при 37°С протягом 2 годин; - промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; дофарбовування 15хв. фарбником Романовського-Гімзи; - промивання в проточній воді протягом 10с; - висушування; - мікроскопування; виявлення активності ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; - підрахунок активності КФн в умовних одиницях за Астальді Верга у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми; - порівняння отриманих даних з показником цього ферменту в популяції і висновок за цим показником про стан активності кислої фосфатази у пацієнта. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити спосіб визначення стану активності кислої фосфатази нейтрофілів (КФн), який шляхом цитохімічної реакції і врахування залежності активності ферменту від місяця року, дозволяє здійснити експрес-оцінку стану активності КФн в обстежуваної особи, підвищити її точність і коректність. Суттєвими ознаками способу є: - реєстрація дати дослідження; - забір крові; - приготування мазка; - швидке висушування його на повітрі; - інкубація мазка з субстратно-буферною сумішшю нафтол-Аз-фосфату, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього (суміш готують і фільтрують перед використанням), після чого мазок витримують у термостаті при 37°С протягом 2 годин; - промивання ізотонічним розчином хлориду натрію; - дофарбовування фарбником РомановськогоГімзи; - промивання в проточній воді; - висушування; 5 30459 - мікроскопування; - визначення активності ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; - підрахунок у 100 нейтрофілах активності КФн в умовних одиницях за Астальді Верга залежно від ступеня забарвлення цитоплазми; - розрахунок відносної активності КФн відн у досліджуваної особи за формулою: КФн п КФнв ідн. = ´ 100% 35 + 5,23х , (1) де КФнвідн - відносна активність КФн в обстежуваної особи, %; КФн п - активність КФн в обстежуваної особи, у.о.; 35 - середньорічна активність ферменту в популяції, у.о.; 5,23 - постійний коефіцієнт місяця, у.о.; х - порядковий номер місяця року; - визначення за цим показником стану активності кислої фосфатази у пацієнта. Відмінними від прототипу ознаками є визначення відносної активності кислої фосфатази за формулою 1 шляхом порівняння результатів активності ферменту КФн пацієнта зі значеннями активності ферменту в популяції у конкретний місяць року та оцінка за цим показником стану активності кислої фосфатази у пацієнта. Спосіб обґрунтовано щомісячними дослідженнями активності ферменту в мазках периферичної крові позаштатних донорів з діагнозом «здоровий» і відсутністю змін у лейкоцитарній формулі (218 осіб, 15-18 осіб щомісячно). Досліджували кров, що відбирається між 9 і 10 годинами ранку, готували мазки, швидко висушували їх, наносили на нефіксовані мазки по 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього, суміш готували і фільтрували перед використанням; мазки інкубували в термостаті при 37°С протягом 2 годин, промивали ізотонічним розчином хлориду натрію, дофарбовували 15хв фарбником Романовського-Гімзи, промивали в проточній воді протягом 10с, висушували і мікроскопували; активність ферменту виявляли за інтенсивністю дифузно-гранулярного синього фарбування цитоплазми у 100 нейтрофілах, яку виражали в умовних одиницях залежно від ступеня забарвлення цитоплазми, для чого досліджувані нейтрофіли розподіляли на 4 групи: з негативною реакцією (–), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++). Статистичний аналіз отриманої бази даних здійснювали за допомогою ППП Statistica 7, модулів «Множинна регресія», «Факторний аналіз», «Часові ряди» і «Графічний аналіз». Активність ферменту в практично здорових осіб не залежить від віку і статі. На основі статистичного аналізу бази даних було встановлено залежність активності кислої фосфатази від місяця року, що відображується рівнянням 6 КФн м =КФнс+5,23х, (2) де: КФн м - активність кислої фосфа тази, що відповідає конкретному місяцю року, у.о.; КФн с - середньорічна активність ферменту в популяції, у.о., дорівнює 35 у.о.; 5,23 - постійний коефіцієнт місяця року, у.о.; х - порядковий номер місяця року; Це рівняння можна представити у вигляді: КФн м =35+5,23х (3) 95% довірчий інтервал дорівнює ±5у.о. Приклад конкретного виконання. Спосіб здійснюють таким чином: реєструють дату дослідження, проводять забір каплі капілярної крові; готують мазок; виконують його швидке висушування, інкубують мазок з субстратно - буферною сумішшю нафтол-Азфосфа ту, для чого наносять на нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містить 10мг нафтол-Аз-фосфату, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього (суміш готують і фільтрують перед використанням), після чого мазок витримують у термостаті при 37±1°С протягом 2±0,05 годин; промивають ізотонічним розчином хлориду натрію; дофарбовують фарбником Романовського-Гімзи; промивають у проточній воді не більш 10с; висушують при кімнатній температурі; мікроскопують, у 100 нейтрофілах проводять підрахунок активності КФн п в умовних одиницях за Астальді Верга, для чого залежно від ступеня забарвлення цитоплазми досліджувані нейтрофіли розподіляють на 4 групи: з негативною реакцією (–), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++); далі число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножують на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складає умовні одиниці (у.о.); визначають відносну активність КФн відн. за формулою 1, і за цим показником роблять висновок про стан активності кислої фосфа тази пацієнта і при значенні показника у діапазоні 100±15 діагностують норму. Приклад конкретного виконання. Пацієнтка К., вік - 29 років. Діагноз - вагітність 31 тиждень, загроза переривання вагітності. Дата дослідження активності КФн - 19 лютого 2005р. Здійснювали забір капілярної крові, готували мазок, швидко висушували його на повітрі, інкубували мазок з субстратно-буферною сумішшю на фтол-Аз-фосфату, для чого заливали нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містило 10мг нафтол-Азфосфа ту, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього (суміш готували і фільтрували перед використанням), після чого мазок витримували в термостаті при 37°С протягом 2 годин, промивали ізотонічним розчином хлориду натрію, дофарбовували фарбником Романовського-Гімзи, промивали в 7 30459 проточній воді, висушували, мікроскопували; визначали активність ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; у 100 нейтрофілах підраховували активність КФн в умовних одиницях за Астальді Верга. Активність ферменту вагі тної жінки складала 76у.о. Розраховували відносну активність КФн відн у пацієнтки за формулою 1: 76 КФнв ідн. = ´ 100% = 169. 75% 35 + 5,23х 2 , Значення активності кислої фосфатази в пацієнтки перевищує показник норми у лютому в середньому на 70%. Отриманий результат характеризує стан активності кислої фосфатази як підвищений. Таким чином, загроза переривання вагітності на 31 тижні у пацієнтки К. характеризується помірним підвищенням активності КФн крові, що в умовах можливого відторгнення плаценти можна розглядати як активацію метаболічної активності головних клітин запалення, що можливо попереджає інфікування матері та плода. Пацієнт Т., вік - 23 років. Діагноз - загострення лівобічного хронічного мезотімпаніту. Дата дослідження активності КФн - 19 лютого 2005р. Здійснювали забір капілярної крові, готували мазок, швидко висушували його на повітрі, інкубували мазок з субстратно-буферною сумішшю на фтол-Аз-фосфату, для чого заливали нефіксований мазок 3мл інкубаційного середовища, що містило 10мг нафтол-Азфосфа ту, розчиненого в 5мл діметілформаміда; 15мл 0,1М цитратного буфера рН 5,2; 45мл дистильованої води; 5мл розчину 0,1М хлориду магнію; 50мг діазоля синього (суміш готували і фільтрували перед використанням), після чого мазок витримували в термостаті при 37°С протягом 2 годин, промивали ізотонічним розчином хлориду натрію, дофарбовували фарбником Романовського-Гімзи, промивали в проточній воді, висушували, мікроскопували; визначали активність ферменту за інтенсивністю синього дифузно-гранулярного фарбування цитоплазми; у 100 нейтрофілах підраховували активність КФн в умовних одиницях за Астальді Верга. Активність хворого складала 100у.о. Розраховували відносну активність КФн відн у пацієнта за формулою: 100 КФнв ідн. = ´ 100% = 102. 29% 35 + 5,23х12 . Відповідно до отриманих даних активність КФн пацієнта Т. при загостренні хронічного мезотімпаніту знаходиться у межах норми, що відповідає уявленням про патогенез захворювання. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє проводити експрес-оцінку стану метаболічної активності клітин обстежуваного з урахуванням стану активності кислої фосфатази в популяції, яка відповідає місяцю дослідження, що забезпечує 8 коректне оцінювання результатів аналізу пацієнта та обумовлює призначення адекватної терапії.