Спосіб фіксації нервових структур кишечнику тварин і птиці, зафарбованих метиленовим синім

1. Спосіб фіксації препаратів нервових структур кишечнику тварин і птиці, зафарбованих метиленовим синім, який включає обробку відібраного матеріалу кишечнику і фарбування його розчином метиленового синього при t=38°C під контролем ступеня поглинання фарби нервовими структурами кишечнику за допомогою лупи МБС-10 та фіксування препаратів, що досягли контрастності, зануренням у ємність з 50-100 кратним об'ємом 3 36893 нические условия применения метода суправитального окрашивания нервных элементов по А.С. Догелю / Современные методы и техника морфологических исследований. - Л.: Медгиз, 1955. С.203-209]. За цим способом досліджувані зразки можна залишати цілими, або готувати з них плівкові препарати чи гістозрізи на заморожуючому мікротомі. В подальшому препарати залишають на 3-5хв на повітрі, постійно зволожуючи фарбуючим розчином. Після цього фільтрувальним папером забирають надлишок фарби і препарати переносять у насичений водний розчин пікриновокислого амонію. Тривалість фіксації 30-60 хвилин - для більших шматочків і 2-3 хвилини для плівкових препаратів та гістозрізів. По закінченню терміну фіксації з препаратів забирають залишки фіксатора при допомозі фільтрувального паперу і переносять їх в 5% водний розчин молібденово кислого амонію. На 100см 3 фіксатора додають 10-20см 3 0,5% осмієвої кислоти. Тривалість фіксації: для більших шматочків - 12-24 години, а для плівкових препаратів та гістозрізів - 3-4 хвилини. Після фіксації плівкові препарати та гістозрізи добре ополіскують у дистильованій воді, зневоднюють на повітрі або шляхом швидкого проведення через спирти (краще у холодильнику), просвітлюють у ксилолі чи толуолі і заливають у бальзам. Більші шматочки ретельно промивають у часто змінюваній дистильованій воді (4-6 годин), зневоднюють у спиртах (краще у холодильнику), просочують терпинеолом, просвітлюють у бензолі і заливають у парафін. Недоліками цього способу є те, що пікриновокислий амоній, на даний час не реалізується в мережі підприємств хімреактивів і потребує спеціального синтезу. Крім цього, він у сухому стані є вибухонебезпечним та належить до прекурсорів. Використовувана осмієва кислота характеризується значною дороговизною і високою токсичністю. При заливці у парафін під час зневоднення у спиртах проходить часткове вимивання фарби з препаратів. Відомий спосіб фіксації нервів, забарвлених метиленовим синім за методом А.Л. Шабадаша [Шабадаш А.Л. Теория и практика прижизненной окраски нервной системы метиленовой синью. Горький, 1932 - 233с.]. Для реалізації способу наркотизованій тварині проводять ін'єкцію фарбуючого розчину в кров'яне русло досліджуваного органу. Особлива увага надається хімічному складу фарбуючого розчину, який для автономних нервових сплетінь готують за прописом: бідистильована вода - 1л; метиленовий синій - 0,2г; глюкоза - 2,0г; хлористий натрій - 7,5г; піровинограднокислий натрій - 0,35г; бромистий магній - 0,3г. рН розчину повинний бути слабо кислим, що забезпечується додаванням фосфатного буфер у. Температура, ізотонічність та тиск ін'єкційного розчину повинні відповідати параметрам досліджуваного органу. Після завершення процесу фарбування, досліджуваний орган видаляють і додатково занурюють у ін'єкційний розчин без метиленового синього для отримання максимуму забарвлення. При досягненні оптимального забарвлення препарат переносять у фіксуючу суміш, яку готують при t - 60°С 4 шляхом насичення 0,9-1,12% водним розчином роданістого амонію оранжевими кристалами пікрату амонію. Тривалість фіксації - 2-8 годин (залежно від товщини препарату). Для органів теплокровних тварин суміш підігрівають до 27-30°С. Після фіксації препарати зберігають у середовищі гліцеринпікрат-желатина, або заливають у бальзам після попереднього дофіксовування молібденовокислим амонієм та осмієвою кислотою. Якщо потрібно виготовити парафінові зрізи, то препарати ще додатково дофіксовують у молібденовокислому амонії з осмієвою кислотою. Недоліками способу є складність проведення ін'єкції фарбуючого розчину, яка потребує значну кількість додаткового обладнання, навичок, реактивів. Фіксуюча суміш складається з двох компонентів, один з яких - пікриновокислий амоній на даний момент не реалізується в мережі підприємств хімреактивів і потребує спеціального синтезу. Крім цього, він у сухому стані є вибухонебезпечним та належить до прекурсорів. А виготовлення парафінових зрізів вимагає додаткової фіксації з використанням осмієвої кислоти, яка характеризується значною дороговизною. Найбільш близьким за суттю до способу, що заявляється, є спосіб фіксації препаратів нервових структур кишечнику, зафарбованих метиленовим синім за методом Бете-Догеля [Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.: Издательство иностранной литературы, 1954. - С.474]. Суть способу полягає у використанні в якості фіксатора 5-8%, свіжоприготованого водного розчину молібденово кислого амонію. Якщо приготований розчин має мутність, його фільтрують. Для кращого зберігання тканинних елементів, до розчину рекомендується додавати 4-6 крапель на 100см 3 1% розчину осмієвої кислоти. Препарати, зафарбовані метиленовим синім, переносять у 50-100 кратний об'єм фіксуючого розчину. Плівкові препарати розтягають на воскових пластинах. Фіксацію проводять при кімнатній температурі протягом 30-60 хвилин (для плівкових препаратів) та до 24 годин для більших препаратів. Після завершення фіксації препарати ретельно промивають (1-6 годин) у часто змінюваній воді. Після цього препарати зневоднюють у спирті та терпінеолі, а далі або просвітлюють у ксилолі і поміщають у бальзам, або заливають у парафін. Заявлений спосіб і прототип мають спільні суттєві ознаки: спосіб включає обробку відібраного матеріалу кишечнику і фарбування його розчином метиленового синього при t=38°C під контролем ступеню поглинання фарби нервовими структурами кишечнику за допомогою лупи МБС-10 та фіксування препаратів, що досягли контрастності, зануренням у ємність з 50-100 кратним об'ємом фіксуючого розчину, промивання 4-5 порціями води протягом 1-6 годин та подальшу обробку залежно від мети виготовлення препарату - зневоднення у спиртах, просвітлення в ксилолі, заливку у парафін, або виготовлення плівкових препаратів шляхом скарифікації слизової оболонки та поміщення у бальзам між предметним і покривним склом. 5 36893 Основними недоліками цього способу є такі: 1. При тривалому зберіганні препаратів (понад 3 дні) у розчині фіксатора проходить їх загнивання. 2. Собівартівсть молібденово кислого амонію є досить значною. 3. Максимально ефективна фіксація тканин досягається лише при додаванні розчину осмієвої кислоти, собівартість якої є надзвичайно високою. Запропонований нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує швидку, якісну, ефективну фіксацію нервових структур на препаратах внутрішніх органів тварин та птиці, які призначені для подальшого опрацювання шляхом виготовлення парафінових та заморожених зрізів, або плівкових препаратів. Цей спосіб є нескладним у виконанні, не потребує значних затрат часу, не вимагає спеціального обладнання, інструментарію, додаткових чи рідкісних реактивів, спеціальної освіти, а тому є зручним для застосування на тваринах у будь-яких морфологічних лабораторіях. В основу корисної моделі покладено завдання розробити зручний і недорогий у практичному використанні, ефективний спосіб фіксації нервових структур кишечнику тварин, зафарбованих метиленовим синім. Технічний результат досягають тим, що після фарбування препарат занурюють у ємність з теплим (t=38°C) фіксуючим розчином 1% фосфорномолібденової кислоти, при цьому фіксацію проводять при кімнатній температурі протягом 1-5 діб, а фіксуючий розчин фосфорномолібденової кислоти готують не раніше, як за 1 місяць до використання, застосовуючи реактив кваліфікації "чда", або "хч", який розчиняють у дистильованій воді, підігрітій до 50°С. Технічний результат заявленого способу обумовлений тим, що як фіксатор використовують 1% розчин фосфорномолібденової кислоти, яка при взаємодії з метиленовим синім, що адсорбувався нервовими структурам кишечнику тварин, утворює у кишковій стінці нерозчинний лак, який запобігає знебарвленню препаратів при їх наступному проведенні через спирти та ксилол. Фіксовані таким способом тканини, можуть в подальшому опрацьовуватися різними морфологічними методиками для виготовлення препаратів нервових структур кишечнику. Зокрема, з них можна виготовляти парафінові та заморожені зрізи, або плівкові препарати шляхом скарифікації слизової оболонки кишкової стінки. Під час проведення досліджень бактерицидні властивості запропонованого фіксатора запобігають розвитку автолітичних процесів у фіксованому матеріалі, що дозволяє зберігати препарати у фіксаторі протягом певного часу (4-5 діб). Ця властивість є важливою при одночасному опрацюванні великої кількості матеріалу. При проведенні патентного пошуку заявником виявлено технічне рішення [Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.: Издательство иностранной литературы, 1954. - 718с.], яке містить найбільшу кількість суттєвих ознак спільних із заявленим рішенням: спосіб включає обробку відібраного матеріалу кишечнику і фарбування його розчином метиленового синього при t=38°C під контролем ступеню поглинання фарби нервовими структурам 6 кишечнику за допомогою лупи МБС-10 та фіксування препаратів, що досягли контрастності, зануренням у ємність з 50-100 кратним об'ємом фіксуючого розчину, промивання 4-5 порціями води протягом 1-6 годин та подальшу обробку залежно від мети виготовлення препарату - зневоднення у спиртах, просвітлення в ксилолі, заливку у парафін, або виготовлення плівкових препаратів шляхом скарифікації слизової оболонки та поміщення у бальзам між предметним і покривним склом. Однак наявність зазначених, спільних з прототипом ознак, є недостатньою для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які за сукупністю ознак повністю співпадали б із заявленим, не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". У патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, у яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату, отримання добре зафіксованих препаратів нервових структур кишкової стінки тварин, зафарбованих метиленовим синім, досягають тим, що після фарбування препарат занурюють у ємність з теплим (t=38°C) фіксуючим розчином 1% фосфорномолібденової кислоти, при цьому фіксацію проводять при кімнатній температурі протягом 1-8 діб, а фіксуючий розчин фосфорномолібденової кислоти готують не більше, як за 1 місяць до використання, застосовуючи реактив кваліфікації "чда", або "хч", який розчиняють у дистильованій воді, підігрітій до 50°С. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію винаходу (корисної моделі) "винахідницький рівень". Заявлений спосіб належить до галузі ветеринарної морфології, зокрема до гістологічних досліджень нервових елементів кишечнику, а саме до способів фіксації препаратів для визначення структурно-функціонального стану кишечнику в нормі та патології. Корисна модель може бути використана в біологічних лабораторіях з різними формами власності для вивчення стану кишечнику, впливу на нього певних лікарських форм, що задаються перорально, та зоотехнії для вивчення реакції кишечнику на складники корму, а тому відповідає критерію винаходу (корисної моделі) "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу, відповідно до [пункту 7 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" №1771 - 2000р. – III]. Відомості, що підтверджують можливість здійснення корисної моделі. Порядок здійснення способу. Реалізацію заявленого способу здійснюють наступним чином: птицю забивають шляхом декапітації, а ссавців загальноприйнятою методикою та максимально знекровлюють. Швидко проводять 7 36893 розтин черевної (грудочеревної у птиці) порожнини і видаляють шлунково-кишковий тракт цілим органокомплексом. У птиці відділяють кишечник, а у ссавців окремі його елементи і занурюють у 0,025% фарбуючий розчин метиленового синього. Температура розчину при допомозі водяної бані підтримується на постійному рівні (+38°С). Процес поглинання фарби нервовими структурами кишкової стінки контролюється за допомогою лупи МБС 10. Після досягнення максимальної насиченості забарвлення та контрастності нервових сплетінь кишки, фарбування припиняють і кишечник занурюють у ємність з теплим (t=+38°С) фіксуючим розчином 1% фосфорномолібденової кислоти, який готується на дистильованій воді. Воду, для кращого розчинення препарату, підігрівають до 50°С. При цьому особливу увагу слід звернути на чистоту препарату, яка повинна відповідати кваліфікації "хч", або "чда". Фіксуючий розчин можна приготувати заздалегідь, але не більше, як за місяць до застосування. Фіксацію проводять при кімнатній температурі протягом 1 доби (можна і довше (2-5 діб), що не впливає на якість препарату). Після фіксації фіксований матеріал піддають подальшій обробці залежно від мети та цілей експерименту. Незалежно від вибраного способу дослідження всі відібрані зразки з фіксованого матеріалу слід промивати 4-5 порціями дистильованої води протягом 5-6 годин. З фіксованого кишечнику вирізають ділянку кишкової трубки довжиною до 30мм, розрізають її вздовж брижового краю і промивають вказаним способом. Далі виготовляють гістопрепарати нервових структур кишечнику шля хом заливки у парафін чи на заморожуючому мікротомі. Також можна виготовляти плівкові препарати шляхом скарифікації слизової оболонки і після зневоднення поміщати між предметним та покривним склом у бальзам. Приклад конкретного виконання способу. В умовах бойні від свиней великої білої породи, корів чорно-рябої породи та овець української гірсько-карпатської породи були відібрані зразки кишкової стінки різних відділів кишечнику та зафарбовані 0,025% розчином метиленового синього. Аналогічні маніпуляції було проведено в умовах птахофабрики зі зразками кишкової стінки різних відділів кишечнику курей кросу Іза-Браун. Весь зафарбований матеріал поділили на дві частини. Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 8 Одну частин у фіксували шляхом занурення у 5%, свіжоприготований водний розчин молібденово кислого амонію (прототип). Другу частину фіксували новим способом у 1% розчині фосфорномолібденової кислоти. Тривалість фіксації при кожному її способі відповідала двом часовим періодам. Половина препаратів фіксувалася протягом однієї доби. Друга половина препаратів витримувалася у фіксуючому розчині 5 діб. Після однодобової фіксації у фіксаторах за прототипом та новим способом зі зразків кишечнику в умовах лабораторії кафедри анатомії сільськогосподарських тварин Львівського національного університету ве теринарної медицини та біотехнолгій імені С.З. Гжицького виготовляли плівкові препарати шляхом скарифікації слизової оболонки і після зневоднення поміщали між предметним та покривним склом у піхтовий бальзам. Готові препарати досліджували при різних збільшеннях лупи МБС - 10 і виявили, що препарати, зафіксовані новим способом порівняно з прототипом, характеризуються вищою щільністю тканин, кращою насиченістю та чіткістю зафарбування нервових сплетінь. Також зафіксовані зразки тканин кишечнику заливали у парафін і з них виготовляли гістологічні препарати за стандартною методикою. Досліджуючи отримані препарати під мікроскопом, виявили, що внаслідок контакту зі спиртами при їх виготовленні пройшло певне зниження інтенсивності забарвлення. Причому у препаратів, зафіксованих за прототипом, вказане знебарвлення було значно суттєвішим порівняно з фіксацією за новим способом. Досліджуючи другу половину препаратів, яка перебувала у розчинах фіксаторів, виявили, що у фіксаторі 5% водного розчину молібденово кислого амонію (прототип) у всі х препаратів почалися процеси автолізу і вони не підлягали подальшому дослідженню. У препаратах, зафіксованих новим методом, аутолітичних змін не виявлено. В подальшому з них були виготовлені плівкові препарати та гістозрізи, які за якістю зафарбування структур не відрізнялися від тих, що перебували у розчині фіксатора лише добу. Таким чином, запропонований нами спосіб фіксації нервових структур кишечнику тварин, зафарбованих метиленовим синім, є більш ефективним порівняно з прототипом. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601