Спосіб виготовлення препаратів нервових сплетінь кишечнику курей

Корисна модель належить до галузі сільськогосподарської біології, зокрема біології сільськогосподарської птиці, а саме до гістологічних досліджень нервових елементів внутрішніх органів курей для визначення структурно-функціонального стану кишечнику в нормі та патології. Спосіб може бути застосований в лабораторіях науково-дослідних установ при вирішенні питань: 1) у ветеринарії - для вивчення реакції нервової системи кишечнику при різних захворюваннях, а також на застосування певних фармакологічних препаратів; 2) у годівлі птиці - для визначення змін у трофічному комплексі кишкової стінки при різних типах годівлі; 3) у науково-дослідній роботі – для дослідження стану кишкової стінки в цілому та її нервового апарату зокрема при різних фізіологічних станах організму, на введення лікарських речовин, вплив на організм зовнішніх стресових факторів та ін. Відомий спосіб виготовлення препаратів нервових елементів, що включає прижиттєве фарбування нервів метиленовим синім за методом Еріха-Догеля [Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.: Издательство иностранной литературы, 1954. - 718с.]. Спосіб полягає у введенні фарбуючого розчину метиленового синього у кровоносне русло чи порожнину тіла, або безпосереднє занурення органу у ємність з цим розчином. Фіксація фарбування здійснюється послідовно розчинами пікриновокислого та молібденовокислого амонію, або лише розчином молібденовокислого амонію. Далі проводять короткочасне зневоднення у спритах зростаючої концентрації. Тонкі плівкові препарати просвітляють у ксилолі і поміщають у канадський бальзам. Товсті зразки заливають у парафін чи целоїдин і виготовляють препарати. Також можна використовувати і заморожуючий мікротом. Недоліками цього способу є те, що він дозволяє отримати досить об'ємні оглядові препарати лише з тонких оболонок органів, брижі, плеври і ін. Товсті препарати вимагають заливки у певні середовища, а отже потребують додаткового обладнання, реактивів, навичок та затрат часу. Крім цього, заливка призводить до суттєвого погіршення якості фарбування, внаслідок контакту зрізів зі спиртом та впливу високої температури термостату. Відомий також спосіб виготовлення препаратів, що включає прижиттєве фарбування нервової системи за методом Шабадаша [Шабадаш А.Л. Теория и практика прижизненной окраски нервной системы метиленовой синью. - Горький: Горьковский медицинский институт, 1939]. Тварині під глибоким наркозом здійснюють перфузію фарбуючого розчину метиленового синього через основну артеріальну судину досліджуваного органу, забезпечуючи відтік розчину через венозні судини. Хімічний склад розчину залежить від мети фарбування. Зафарбований матеріал фіксують у розчині пікриновокислого амонію і зберігають у гліцерин-пікрат-желатині. Також фіксований матеріал можна додатково зафіксувати у розчині молібденовокислого амонію порізати на заморожуючому мікротомі та помістити у канадський бальзам. Недоліком способу є те, що він не адаптований для птиці, потребує фіксуючих пристроїв, навичок і реактивів для проведення наркозу, обладнання для здійснення перфузії фарбуючої суміші. Крім цього, тривале зберіганні препаратів у гліцерин-пікрат-желатині призводить до втрати їх забарвлення. При поміщенні у бальзам вимагається наявність заморожуючого мікротому, при цьому неможливо отримати об'ємних оглядових препаратів. Відомий також спосіб виготовлення препаратів, що включає прижиттєве фарбування різних типів нервових закінчень на плівкових препаратах сечового міхура жаб [Вшивцева В.В. Зависимость прижизненной окраски различных типов нервных окончаний от рН раствора красителя // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1984. - №7. - с.83-87]. Із сечових міхурів жаб виготовляли плівкові препарати, розтягали їх на предметних склах, фарбували аплікацією хлористого метиленового синього та фіксували висушуванням при допомозі спеціального пристрою. Висушені препарати просвітлювали у ксилолі та поміщали у даммарову смолу. Особливу увагу в процесі досліду звертали на показник рН фарбуючого розчину, який коливався в діапазоні від 4,0 до, 7,0. Недоліком способу є те, що він дозволяє виготовляти оглядові препарати лише з тонкостінних органів. Крім цього, він потребує дорогої та на даний час майже не доступної даммарової смоли. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб виготовлення гістопрепаратів нервових сплетінь, що включає прижиттєве фарбування нервових елементів, шляхом трансфузії фарбуючого розчину [Торская И.В. Технические условия применения метода суправитального окрашивания нервных элементов по А.С. Догелю / Современные методы и техника морфологических исследований. - Л.: Медгиз, 1955. - с.203-209]. Для реалізації даного способу тварину фіксують у лежачому положенні і вводять в стан глибокого наркозу. Після розтину поверхневих тканин тіла і формуванні достатнього доступу до вивчаємого органу, в його основні кровоносні судини: приносну (артерію) та виносну (вену) вставляють канюлі, через які здійснюють трансфузію фарбуючого розчинну (метиленового синього 0,01%). Для забезпечення отримання оптимальних результатів фарбування слід обов'язково контролювати два важливі показники: температуру та тиск фарбуючого розчину. Його температура повинна відповідати температурі тіла тварини, тому фарбуючий розчин слід постійно нагрівати на водяній бані. Тиск фарбуючого розчину не повинен перевищувати максимальний артеріальний тиск піддослідної тварини. Його регуляцію здійснюють при допомозі манометра. Тривалість процесу фарбування (трансфузії) залежить від морфофункціональних особливостей органу і може сягати 40-50 хвилин. Для досягнення максимуму забарвлення досліджуваних органів їм слід забезпечити доступ кисню. Для цього розтинають порожнини тіла, якщо вони не були розтяті під час формування доступу до органу та вставляння канюль. У процесі фарбування тварина гине. Після завершення фарбування відбирають зразки матеріалу з досліджуваного органу, з яких можна виготовляти зрізи на заморожуючому мікротомі. Отримані зрізи також слід витримувати на повітрі 3-5хв, постійно зволожуючи фарбуючим розчином, щоб підтримувати оптимум зафарбування. Якість зафарбування контролюють під малими збільшеннями мікроскопа. Після цього весь відібраний матеріал фіксується шляхом послідовного проведення через слабкі розчини пікриновокислого (0,15%) та молібденово кислого (2,5%) амонію. Тривалість фіксації у кожному фіксаторі 3-4 хвилини. Після другого фіксатора матеріал ополіскують дистильованою водою і переходять до його зневоднення. Для цього фіксовані дослідний матеріал (зрізи) кладуть на скло, ретельно розправляють і спочатку підсушують складеним у кілька разів фільтрувальним папером шляхом його помірного притискання до матеріалу. Потім вказані скла не менше доби сушать на повітрі під ковпаком (у темноті). Висушені препарати просвічують у ксилолі чи толуолі шляхом його накапування на препарат та швидкого відсмоктування (1-2 рази).Далі препарати поміщають у канадський бальзам. При цьому тонкі препарати (мікротомні зрізи) накривають покривними скельцями, а товсті препарати заливають кількома шарами канадського бальзаму. Якщо препарати містять багато жиру, то після фіксації і ополіскування дистильованою водою, їх змочують на кілька секунд спочатку трьома порціями 96° спирту, потім трьома порціями спирт-ефіру і на завершення трьома порціями ефіру. Розчини наносять піпеткою і відразу ретельно їх знімають фільтрувальним папером, складеним у кілька шарів. Потім препарати обробляють вказаним вище способом. Основними недоліками цього способу є такі: 1. Він розроблений для ссавців і не адаптований для птиці, яка характеризується меншими розмірами, єдиною грудочеревною порожниною (замість грудної та черевної), специфічними параметрами кровообігу (лівою дугою аорти та ін.). 2. Для проведення трансфузії тварину слід ввести у стан глибокого наркозу, а це вимагає специфічних навиків та препаратів, оскільки звичайні умови інгаляційного наркозу курям не підходять, бо дія ефіру на них слабо виражена, а від хлороформу вони швидко гинуть. 3. Процес трансфузії вимагає підтримання постійного тиску, а отже наявності компресора з манометром. 4. Для фіксації матеріалу використовується два фіксатори, один з яких, а саме пікриново-кислий амоній, на даний момент не реалізовується в мережі підприємств хімреактивів і потребує спеціального синтезу. 5. Висушування препаратів на повітрі навіть протягом доби не гарантує їх достатнього зневоднення. 6. Товсті препарати покриті кількома шарами канадського бальзаму є не зручними у зберіганні, бо дуже чутливі до пилу, а також не практичні для мікроскопії великих збільшень, бо імерсійне масло залишає на них сліди. 7. Виготовлення тонких препаратів на заморожуючому мікротомі потребує додаткового обладнання. Також це не дозволяє отримати одночасно препарат міжм'язового та підсерозного сплетінь. Запропонований нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує швидке, якісне, ефективне виготовлення плівкових препаратів міжм'язового та підсерозного сплетінь кишечнику курей, які призначені для тривалого зберігання та використання. Цей спосіб є нескладним у виконанні, не потребує великих фінансових витрат та значних затрат часу. Не вимагає спеціального обладнання, інструментарію, фіксуючих засобів, рідкісних реактивів, спеціальної медичної освіти, а тому є зручним для застосування на курях у будь яких морфологічних лабораторіях. В основу корисної моделі покладено завдання розробити зручний і економічно вигідний у практичному використанні, ефективний спосіб виготовлення плівкових препаратів міжм'язового та підсерозного нервових сплетінь кишкової стінки курей, які б можна було зберігати тривалий термін для використання у навчальному процесі. Технічний результат досягається тим, що призначену для виготовлення препаратів птицю забивають шляхом декапітацїї і максимально знекровлюють. Фарбування нервових сплетінь кишечнику здійснюють зануренням відділеного органну у ємність з 0,025% розчином метиленового синього. Процес поглинання фарби нервовими структурами контролюють, використовуючи лупу МБС-10, а після досягнення контрастності нервових сплетінь здійснюють фіксацію зануренням кишківника у ємність з фіксуючим розчином в холодильнику, де витримують 24 години при t=5°C. Після промивання кишечну трубку розрізають вздовж брижового краю, промивають і скарифікують слизову оболонку стандартним лезом бритви. При фіксуванні пінцетом, вирізають ділянки скарифікованої кишечної трубки для препаратів за розмірами покривних скелець, ополіскують дистильованою водою, обсушують фільтрувальним папером, зневоднюють у спиртах висхідної концентрації в холодильнику при t=5°С, переносять послідовно у 2 порції ксилолу з витримуванням по 1 годині в кожній і занурюють у бюкс з піхвовим бальзамом, розведеним ксилолом. Кожний препарат поміщають на предметне скло м'язовою оболонкою до низу, а на серозну оболонку накладають покривне скло, не допускаючи попадання бульбашок повітря. Технічний результат способу обумовлений значним зменшенням товщини стінки кишечнику внаслідок скарифікації її слизової оболонки. Це сприяє кращому просвітленню стінки, а отже суттєво покращує її проникність для світлових променів оптичних систем мікроскопа. Це дозволяє отримані плівкові препарати залити у піхтовий бальзам між предметним та покривним склом, що забезпечить їх тривале зберігання і використання. Поряд з тим даний спосіб дає змогу краще виявити співвідношення між окремими структурними частинами міжм'язового та підсерозного нервових сплетінь, що залягають на різній глибині і для цього не потребує виготовлення серій зрізів. При проведенні патентного пошуку заявником виявлено технічне рішення (Торская И.В. Технические условия применения метода суправитального окрашивания нервных элементов по А.С. Догелю / Современные методы и техника морфологических исследований. - Ленинград: Медгиз, 1955. - с.203-209), яке містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим рішенням: спосіб включає розтин поверхневих тканин тіла, формування доступу та видалення органу, що містить нервові сплетіння. Далі проводять фарбування нервових елементів трасфузією фарбуючого розчину метиленового синього, відбирання зразків матеріалу із зафарбованими нервовими елементами, фіксацію зразків здійснюють занурюванням в 5% розчин молібденовокислого амонію. Після фіксації зразки промивають у проточній воді, висушують на повітрі, просвічують у ксилолі чи толуолі та покривають покривними скельцями або заливають у канадський бальзам. Однак наявність зазначених, спільних з прототипом ознак, є недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". У патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, у яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату: призначену для виготовлення препаратів птицю забивають шляхом декапітації і максимально знекровлюють, фарбування нервових сплетінь кишечнику здійснюють зануренням відділеного органну у ємність з 0,025 розчином метиленового синього, процес поглинання фарби нервовими структурами контролюють використовуючи лупу МБС-10, а після досягнення контрастності нервових сплетінь здійснюють фіксацію зануренням кишківника у ємність з фіксуючим розчином в холодильнику, де витримують 24 години при t=5°С, після промивання кишечну трубку розрізають вздовж брижового краю, промивають і скарифікують слизову оболонку стандартним лезом бритви при фіксуванні пінцетом, вирізають ділянки скарифікованої кишечної трубки для препаратів за розмірами покривних скелець, ополіскують дистильованою водою, обсушують фільтрувальним папером, зневоднюють у спиртах висхідної концентрації в холодильнику при t=5°С, переносять послідовно у 2 порції ксилолу з витримуванням по 1 годині в кожній і занурюють у бюкс з піхтовим бальзамом, розведеним ксилолом. Далі кожний препарат поміщають на предметне скло м'язовою оболонкою до низу, а на серозну оболонку накладають покривне скло, не допускаючи попадання бульбашок повітря. Отже заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про його відповідність критерію винаходу (корисної моделі) "винахідницький рівень". Заявлений спосіб належить до галузі сільськогосподарської біології, зокрема біології сільськогосподарської птиці, а саме до гістологічних досліджень нервових елементів внутрішніх органів курей для визначення структурно-функціонального стану кишечнику в нормі та патології, а тому відповідає критерію винаходу (корисної моделі) "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу (корисної моделі), відповідно до статті 7 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" №1771 - III, 2000р. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: птицю забивають шляхом декапітації та максимально знекровлюють. Швидко проводять розтин грудочеревної порожнини і видаляють шлунково-кишковий тракт цілим органокомплексом. Відділяють кишечник і занурюють його у 0,025% фарбуючий розчин метиленового синього, приготованого за методом А.Л. Шабадаша (1939) температурою 38°С. Процес поглинання фарби нервовими структурами кишкової стінки контролюється за допомогою лупи МБС - 10. Після досягнення максимальної контрастності нервових сплетінь кишки фарбування припиняють і кишечник занурюють у ємкість з фіксуючим розчином 5% молібденово кислого амонію (t=38°С). Дану ємність охолоджують у холодильнику (t=5°С) і витримують при цій температурі протягом всього часу фіксації - 24 години. Після фіксації органокомплекс кишечнику промивають у проточній воді 5-7 годин. Із фіксованого матеріалу вирізають ділянку кишкової трубки довжиною до 30мм розрізають вздовж брижового краю, промивають у проточній воді від вмістимого і скарифікують слизову оболонку стандартним лезом бритви. При цьому краї препарату притримують очним пінцетом. Далі під контролем лупи МБС - 10 вирізають кращу ділянку розміром менше 24x24мм, що обумовлено стандартними розмірами покривних скелець. Подальша обробка препаратів полягає у ополіскуванні їх дистильованою водою, обсушуванні фільтрувальним папером при помірному стисканні і наступному зневодненні у спиртах висхідної концентрації: 96° – 1 година, абсолютний - 1 година. Даний процес проводиться у холодильнику (t=5°С) для запобігання вимивання фарби з препарату. Після цього зневоднені шматочки переносять послідовно у дві порції ксилолу по 1 годині в кожній. Кінцевий етап виготовлення препарату полягає у тому, що шматочок занурюють у ємність (бюкс) з піхтовим бальзамом, який заздалегідь розводять ксилолом до консистенції штучного меду. Далі шматочок кладуть на предметне скло м'язовою оболонкою до низу. На серозну оболонку, вкриту бальзамом, накладають покривне скло, не допускаючи попадання під нього бульбашок повітря. Весь кінцевий етап здійснюють під контролем лупи МБС - 10. В умовах лабораторії кафедри анатомії сільськогосподарських тварин Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького було сформовано дві групи птиці по п'ять клінічно здорових курей в кожній, кросу "Іза-Браун", віком один рік, які утримувалися в однакових умовах птахівничого господарства. В одній групі проводили дослідження нервової системи кишечнику за допомогою вже відомого способу (прототип) шляхом виготовлення зрізів на заморожуючому мікротомі, а у другій групі - новим, запропонованим нами, способом зі скарифікацією слизової оболонки. Процес виготовлення та дослідження препаратів, виготовлених новим способом був значно простішим зручнішим та ефективнішим порівняно із прототипом. Крім цього новий спосіб дозволяє отримати більш достовірні результати досліджень. Порівняльний аналіз препаратів, виготовлених різними способами, подано у таблиці 1. Таблиця 1 Прототип Вимагає: фіксуючих пристроїв, наркотичних препаратів, додаткового обладнання (компресор, манометр, заморожуючий мікротом), рідкісних реактивів(пікриновокислий амоній), спеціальних навичок. Новий спосіб Не потребує: фіксуючих пристроїв, наркотичних препаратів, додаткового обладнання (компресор, манометр, заморожуючий мікротом), рідкісних реактивів (пікриновокислий амоній), спеціальних навичок. Значно більша площа препарату дозволяє побачити Невелика площа зрізу дозволяє спостерігати лише більш об'ємну картину нервового сплетіння незначний фрагмент нервового сплетіння кишечнику. кишечнику. Щоб дійти до нервових міжм'язових структур, слід Для дослідження нервових міжм'язових структур зробити багато зайвих зрізів і всі їх треба достатньо лише сфокусувати оптичну систему переглянути, щоб непропустити потрібного. мікроскопу на потрібній глибині препарату. На одному зрізі можна спостерігати лише структури На одному препараті можна спостерігати структури або підсерозного, або міжм'язового сплетінь. підсерозного та міжм'язового сплетінь. Невелика площа і товщина зрізу не дозволяє Значно більша площа і товщина зрізу дозволяє ретельно дослідити зв'язок нервових структур краще дослідити зв'язок нервових структур підсерозного та м'язового сплетінь між собою та з підсерозного та м'язового сплетінь між собою та з навколишніми тканинами навколишніми тканинами Зафарбування нервових структур кишечнику є менш Зафарбування нервових структур кишечнику є більш інтенсивним. інтенсивним. Чіткість виявлення дрібних нервових структур є Чіткість виявлення дрібних нервових структур є слабшою. сильнішою. Таким чином, запропонований нами спосіб виготовлення препаратів міжм'язового та підсерозного нервових сплетінь кишечнику курей, призначених для тривалого зберігання, є більш ефективним порівняно з прототипом.