Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка

Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка, що включає імуногістохімічний аналіз зразків пухлини з визначенням Екадгерину та β-катеніну, який відрізняється тим, що на депарафінізовані зрізи зразків пухлин наносять моноклональні антитіла і при наявності позитивної реакції з моноклональними антитілами проти білків р53, BCL-2, EGFR, HER-2/neu та VEGF прогнозують тривалість періоду виживаності до 1 року, а при позитивній реакції з α-катеніном - понад 3 роки. (19) (21) u200809284 (22) 16.07.2008 (24) 10.11.2008 (46) 10.11.2008, Бюл.№ 21, 2008 р. (72) БАЗАСЬ ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ, UA, ЛУК'ЯНОВА НАТАЛІЯ ЮРІЇВН А, U A, ДЕМАШ ДМИТРО ВАЛЕРІЙОВИЧ, U A, ГАЛАХІН КОСТЯНТИН ОЛЕКСАНДРОВИЧ, U A, М'ЯСОЄДОВ ДМИТРО ВОЛОДИ МИРОВИЧ, U A (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАЦІОН АЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, UA, ДЕРЖАВН А УСТАНОВА 3 37073 чином: Після хірургічного втручання пухлинну тканину фіксують у 10%-му водному розчині нейтрального формаліну і заливають в парафін за загальноприйнятим методом. Імуногістохімічне дослідження (ІГХД) експресії білків р53, BCL-2, HER-2/neu, EGFR, Е-кадгерину, α-, та β-катеніну, та VEGF проводиться на парафінових зрізах пухлинної тканини. Депарафіновані зрізи товщиною 4-6мкм, монтуються на скельця, покриті полі-L-лізіном або на скельця з адгезивними властивостями SuperFrost Plus (Німеччина) і залишаються на добу в термостаті при 37°С, або ж на 30 хвилин в термостаті при 56°С у разі застосування скелець (Super Frost Plus). У день проведення імуногістохімічної реакції проводиться депарафінування та зневоднення зрізів. Для оптимального імуногістохімічного визначення експресії антигенів проводять демаскування антигенів в розчині 0,1М цитратного буфер у (рН 6,0), шляхом інкубування у мікрохвильовий печі протягом 2хв за потужності 600Вт, або на водяній бані протягом 20хв за температури 90°С з подальшим охолодженням скелець до кімнатної температури у розчині цитратного буферу. Надалі виявлення антигенів, проводять у вологій камері при кімнатній температурі. Для зменшення неспецифічного забарвлення на зрізи наносять 1%-ий розчин бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Білки, що входять до його складу, блокують усі високозаряджені неспецифічні ділянки, з якими може відбутися неспецифічне зв'язування мАТ. Потім проводять інкубацію препаратів з моноклональними антитілами, специфічними до вищезазначених білків протягом однієї години. Після цього зрізи тричі відмивають у фізіологічному розчині NaCl, забуференому фосфа тами (ЗФР), рН 7,4. Всі інкубаційні цикли, що передбачені при імуногістохімічному виявленні антигенів, проводять у вологій камері при кімнатній температурі. Для візуалізації застосовують систему «EnVision+» (Dako Cytomation, Данія), яку наносять після МКАТ, то гісто хімічне визначення активності пероксидази проводять безпосередньо через 30 хвилин інкубації з вищевказаною системою. Після виявлення активності пероксидази або лужної фосфатази зрізи тканини пухлин дофарбовують гематоксиліном протягом 2-3хв. і укладають в бальзам або Faramount Aqueous Mounting Medium (DakoCytomation, Данія). Оцінку результатів фарбування проводять за допомогою світлового мікроскопу (збільшення х400). Пухлину вважають р53-позитивною, якщо в тканині пухлини позитивна реакція спостерігається більше, ніж у 5% ядер пухлинних клітин. Для ідентифікації інших маркерів (Е-кадгерину, α-, та βкатеніну, рецепторів епідермального фактору росту, HER-2/neu та фактору росту ендотелію судин) пухлину вважають позитивною, якщо кількість клітин, з даним білком більша за 20%. Нами встановлено, що високі показники виживаності пов'язані з присутністю у зразках Е 4 кадгерину, α-, та β-катеніну, а також з відсутністю позитивної реакції з антитілами проти білків р53, BCL-2, HER-2/neu, EGFR та VEGF. Натомість, наявність у пухлинах білків р53, BCL-2, HER-2/neu, EGFR та VEGF та відсутність білків кадгеринкатенінового комплексу пов'язана з несприятливим прогнозом перебігу захворювання. Прикладами конкретного виконання заявленого способу можуть бути виписки з історій хвороб двох пацієнтів. 1. Хворий Л., 68 років. Історія хвороби №101208. Діагноз - недиференційована карцинома шлунку, яка була хірургічно видалена 04.03.2001 р. з встановленням стадії пухлинного процесу pT3N1M0 (патогістологічне заключения 4213-20/01). Після хірургічного видалення пухлини за правилами загальноприйнятої технологічної процедури обробки біологічного матеріалу вироблявся парафіновий блок. ІГХД експресії білків р53, BCL-2, HER-2/neu, EGFR, Е-кадгерину, α-, та βкатеніну, та VEGF було проведено на парафінових зрізах пухлинної тканини за вищевказаною методикою. В результаті проведення ІГХД встановлено наявність у пухлині білків р53 та VEGF, HER-2/neu, а також відсутність BCL-2, EGFR, Е-кадгерину, α-, та β-катеніну, на підставі чого можна стверджувати про несприятливий прогноз перебігу захворювання. Незважаючи на радикальне лікування раку шлунку, через 17 місяців від дати встановлення діагнозу розвинулись множинні метастази (в печінку, брюшину, регіонарні лімфатичні вузли), а через 19 місяців хворий помер. 2. Хвора Г., 74 роки. Історія хвороби №101371. Діагноз - аденокарцинома шлунку, яка була хірургічно видалена 21.03.2001 р. з встановленням стадії пухлинного процесу pT3N1M0 (патогістологічне заключения №4854-59/2001). Після хірургічного видалення пухлини за правилами загальноприйнятої технологічної процедури обробки біологічного матеріалу вироблявся парафіновий блок. ІГХД експресії білків р53, BCL-2, HER-2/neu, EGFR, Eкадгерину, α-, та β-катеніну, та VEGF було проведено на парафінових зрізах пухлинної тканини за вищевказаною методикою. В результаті проведення ІГХД встановлено присутність у пухлині Е-кадгерину, α-, та βкатеніну, а також HER-2/neu, а також відсутність р53, BCL-2,EGFR та VEGF, що дозволяє стверджувати про сприятливий прогноз. В результаті проведеного радикального лікування раку шлунку протягом 7 років метастази не розвинулись і хвора жива. Таким чином, за заявленим способом, присутність зазначених вище білків корелює з розвитком метастазів та тривалістю періоду виживаності хворих на рак шлунку, що свідчить про об'єктивність даного способу. Спосіб виконано у 150 хворих на рак шлунку, які перебували на стаціонарному лікуванні в ДУ "Національний інститут раку", узагальнені результати представлені в таблицях 1, 2. 5 37073 6 Табл. 1 Розподіл пухлин, в клітинах яких спостерігається наявність досліджуваних маркерів залежно від наявності метастазів Маркер р53 BCL-2 Е-кадгерин α-катенін β-катенін EGFR HER-2/NEU VEGF Відсоток пухлин, позитивних за даним маркером залежно від наявності метастазів Метастазів немає Метастази є 41.27% 52.87% 38.10% 24.14% 74.60% 21.84% 61.90% 14.94% 34.92% 24.14% 39.68% 25.29% 28.57% 36.78% 34.92% 51.72% Прогностичне значення присутності білку у п ухлині Немає Сприятливий прогноз Сприятливий прогноз Сприятливий прогноз Сприятливий прогноз Сприятливий прогноз Немає Несприятливий прогноз Табл. 2 Розподіл пухлин, в клітинах яких спостерігається наявність досліджуваних маркерів залежно від тривалості періоду виживаності хворих Маркер р53 BCL-2 Е-кадгерин α-катенін β-катенін EGFR HER-2/NEU VEGF Відсоток пухлин, позитивних за даним маркером залежно від тривалості періоду виживаності 0-1 рік 1-3 роки понад 3 роки 67.53 26.67 28.57 41.56 11.11 14.29 16.88 66.67 82.14 19.48 31.11 78.57 33.77 24.44 21.43 40.26 24.44 17.86 41.56 26.67 21.43 64.94 24.44 21.43 Джерела інформації 1. BJ. Dicken, D.L. Bigam, C. Cass et al. / Gastric Adenocarcinoma. Review and Considerations for Future Directions // Ann Surg. - 2005. - Vol. 241, №1. - P. 27-39. 2. Lauren P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinaltype carcinoma, an attempt at a histo-clinical classification // Acta Pathol. Microbiol. Scand. - 1965. - Vol. 64. - P. 31-49. 3. TNM classification of malignant tumours (5th ed.) / Eds. L.H. Sobin, С Wittekind. - New York, Chichester, Weinheim, Brisbane, Singapore, Toronto: Wiley-Liss, 1997. - 285 p. 4. van Krieken J.H., Sasako M., van de Vele CJ. Gastric cancer. / Prognostic factors in cancer Eds. Gospodarowicz M.K., Henson D.E., Hutter R.V.P et al. - New York: Wiley-Liss, 2001. - P. 251-265. Прогностичне значення присутності білку у пухлині Несприятливий прогноз Несприятливий прогноз Сприятливий прогноз Сприятливий прогноз Сприятливий прогноз Несприятливий прогноз Несприятливий прогноз Несприятливий прогноз 5. I. Uberall, Z. Kolar, R. Trojanec et al. / The status and role of ErbB receptors in human cancer // Exper. Molecular Pathol. - 2008. - Vol. 84, №2. - P. 79-89. 6. A.G. Xu, S.S. Li, J.H. Liu et al. / Function of apoptosis and expression of the proteins Bcl-2, p53 and C-myc in the development of gastric cancer // World J Gastroenterol. - 2001. - Vol. 7, №3. - P. 403406. 7. L. Zheng, L. Wang, J. Ajani et al. / Molecular basis of gastric cancer development and progression // Gastric Cancer. - 2004. - Vol. 7. - P. 61-77. 8. T. Ohno, R. Aihara, Y. Kamiyama et al. / Prognostic significance of combined expression of MUC1 and adhesion molecules in advanced gastric cancer. // Eur. J. Cancer. - 2006. - Vol. 42, №2. - P. 256-263. (прототип) 7 Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 37073 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601