Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на злоякісні неепітеліальні пухлини молочної залози

Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на злоякісні неепітеліальні пухлини молочної залози, що включає імуногістохімічний аналіз клітинного складу видаленої пухлини, який відрізняється тим, що в полі зору визначають процентне відношення клітин, які експресують васкулярний ендотеліальний фактор росту, до загального об'єму пухлинних клітин, і при його величині, рівній або більшій 20% пухлинних клітин, визначають низькі показники виживаності, а при наявності менш ніж 20% - високі показники виживаності. (19) (21) u200711828 (22) 26.10.2007 (24) 25.01.2008 (72) ЧЕХУН ВАСИЛЬ ФЕДОРОВИЧ, UA, ГАЛАХІН КОСТЯНТИН ОЛЕКСАНДРОВИЧ, UA, СМОЛАНКА ІВАН ІВАНОВИЧ, U A, ЛУК'ЯНОВА Н АТАЛІЯ ЮРІЇВНА, UA, ШУЛІГА-НЕДАЙ ХЛЄБОВА ОКСАН А ВАСИЛІВНА, UA, МИКИТЕНКО ДМИТРО ОЛЕКС АНДРОВИЧ, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ" АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ, UA, ДЕРЖАВН А УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ П АТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІО 3 29862 Імуногістохімічне дослідження (ІГХД) експресії VEGF проводиться на парафінових зрізах пухлинної тканини. Парафінові зрізи товщиною 4-6 мкм, монтуються на скельця, покриті полі-L-лізіном або на скельця з адгезивними властивостями Super Frost Plus (Німеччина) і залишаються на добу в термостаті при 37°С, або ж на 30 хвилин в термостаті при 56°С у разі застосування скелець (Super Frost Plus). У день проведення імуногістохімічної реакції проводиться депарафінування та обезводнювання зрізів. Для оптимального імуногістохімічного визначення експресії антигенів проводять демаскування антигенів, шляхом обробки зрізів 0,06%-вим розчином трипсину протягом 10 хвилин при 37°С або здійснюють обробку зрізів в мікрохвильовий печі в розчині цитратного буферу (рН - 6,0). Всі інкубаційні цикли, що передбачені при імуногістохімічному виявленні антигенів, проводять у вологій камері при кімнатній температурі. Для зменшення неспецифічного забарвлення на зрізи наносять 1% розчин бичачого сироваткового альбуміну (BSA), оскільки білки, що входять до його складу, займають усі високозаряджені неспецифічні ділянки, з якими може відбутися неспецифічне зв'язування моноклональних антитіл (МКАТ). Потім проводять інкубацію препаратів з первинними МКАТ в оптимальному розведенні протягом однієї години. Через годину зрізи відмивають 3 рази у забуфериному фізіологічному розчині (ЗФР). Після цього на скельця зі зрізами наносять кролячу сироватку проти імуноглобулінів миші в надлишковому титрі на годину. Далі скельця зі зрізами знову відмивають в ЗФР та інкубують з пероксидаза-анти-пероксидаза (ПАП) комплексом протягом 45 хвилин. Після відмивання ПАП комплексу, що не зв'язався з кролячою антимишиною сироваткою проводять реакцію імуногістохімічного визначення активності пероксидази. Якщо для візуалізації застосовують систему «EnVision», яку наносять після МКАТ, то гістохімічне визначення активності пероксидази проводять безпосередньо через 30 хвилин інкубації з вищевказаною системою. Після виявлення активності пероксидази або лужної фосфатази зрізи тканини пухлин дофарбовують гематоксиліном протягом 23хв. і укладають в бальзам або Faramount Aqueous Mounting Medium (DacoCytomation, Данія). Оцінку результатів фарбування проводять за допомогою світлового мікроскопу (збільшення х 200, 400). Пухлину вважають негативною за VEGF, якщо в тканині пухлини відсутня реакція з антитілами, 4 або кількість пофарбованих клітин менша за 20%, і позитивною за маркером, якщо пофарбовано більш 20% цитоплазми пухлинних клітин (Фіг.1, Фіг.2). Встановлено, що коли рівень експресії становить більше 20% цитоплазми пухлинних клітин визначають низькі показники виживаності, а при наявності менш ніж 20% - вищі показники виживаності. Прикладами конкретного виконання заявленого способу можуть бути виписки з історій хвороб двох пацієнтів. 1. Хвора М., 83 роки. Історія хвороби №110325. У Київському міському онкологічному диспансері діагностована ліпосаркома молочної залози, яка була хірургічно видалена 05.07.2001р. з встановленням мікроскопічного діагнозу (патогістологічне заключения №16662-3.01). Після хірургічного видалення пухлини за правилами загальноприйнятої технологічної процедури обробки біологічного матеріалу вироблявся парафіновий блок, котрий за вищевказаною методикою піддавався ІГХД. В результаті проведення ІГХД встановлено експресію VEGF на рівні 50%, що кваліфікується як присутність високого ступеню експресії та оцінюється як прогноз несприятливий. Незважаючи на радикальне лікування СМЗ, через 19 місяців від дати встановлення діагнозу хвора померла. 2. Хвора К., 48 років. Історія хвороби №112726. У Київськійміській онкологічній лікарні діагностована ліпосаркома молочної залози, яка була хір ургічно видалена 06.09.2001р. з встановленням мікроскопічного діагнозу (патогістологічне заключения № 21237-44.01). Після хірургічного видалення пухлини за правилами загальноприйнятої технологічної процедури обробки біологічного матеріалу вироблявся парафіновий блок, котрий за вищевказаною методикою піддавався ІГХД. В результаті проведення ІГХД встановлено експресію VEGF на рівні 0%, що кваліфікується як відсутність експресії та оцінюється як прогноз сприятливий. В результаті проведеного радикального лікування СМЗ протягом 5 років метастази не розвинулись і хвора жива. Таким чином, за заявленим способом показник рівня експресії VEGF принципово корелює з розвитком метастазів, строками летальності та виживаності хворих на СМЗ, що свідчить про його об'єктивність. Спосіб виконано у 51 хворої на СМЗ і узагальнені результати представлені в таблиці 1. 5 29862 6 Таблиця 1 Прогностична оцінка перебігу СМЗ Рівень експресії Статус пацієнта VEGF Негативний 25 осіб Позитивний 26 осіб Живих 22 особи Померлих 3 особи Живих 9 осіб Померлих 17 осіб Ризик метастазу вання Прогноз хвороби Низький Сприятливий Високий Несприятливий Пояснення до ілюстративних матеріалів корисної моделі: Фіг.1. Позитивний рівень експресії VEGF у хворих на СМЗ (х 400) Фіг.2. Негативний рівень експресії VEGF у хворих на СМЗ (х400). Джерела інформації 1. Nash A.D. Soft tissue sarcomas: histological diagnosis. - New - York: Raven Press, 1989. - P. 6376. Виникнення ме- Досліджений тетастазів в рмін виживаності абс.ч.(%) 5 (20%) До 5 років 9 (35%) Від 5 до 10 років 2. Breast sarcomas /H. Ohta, T. Komibuchi, N. Nishio et al. //Annals Nuclear Medicine. - 1997. - Vol. 11, № 37. -P. 1239-1247. 3. Пат. № 19840671, DE, МПК G01N33/574. Predicting the recurrence of tumors in nodal-negative mammary carcinoma patients on basis of low vascular endothelial growth factor and urokinase-type plasminogen activator levels /Stiftung tumorbank Basel (CH). -3.№ 19981040671; Заявл.04.10.1998; Опубл.02.03.2000 (прототип). 7 Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 29862 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601