Спосіб діагностики та контролю wx-генів при створенні сортів пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози

Спосіб діагностики та контролю Wх-генів при створенні генотипів пшениці з низьким або нульовим вмістом амілози в крохмалі включає: ПЛР 3 37137 дібрані лінії характеризуються за допомогою спектрофотометрії, на етапі дозрілого зерна. Відмінними від прототипу ознаками в корисній моделі, що заявляється, є: - спосіб може бути застосовано в F3 поколінні для добору гомозиготних рослин; - при застосуванні спектрофотометричної оцінки вмісту амілози використовуються оптимальні параметри: діапазон довжин хвиль (400-750нм), форма подання оптичних даних (абсорбція та її перша похідна), спосіб градуювання (одна точка спектра або група точок); - за застосування оптимальних параметрів досягнута в 1,5 рази вища роздільна здатність порівняно з базовою процедурою (абсорбція при 600нм, проста лінійна регресія). Запропонований спосіб може бути використаний в генетико-селекційних дослідженнях для: 1. Скорочення строків селекційних програм при створенні форм пшениці з блокованим (частково чи повністю) синтезом амілози; 2. Добору генотипів з різними комбінаціями Wx генів (Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1a; Wx-A1b, Wx-B1a, Wx-D1a; Wx-A1b, Wx-B1a, Wx-D1b; Wx-A1a, WxB1a, Wx-D1b; Wx-A1a, Wx-B1b, Wx-D1a; Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b та ін.) 3. Контролю селекційного процесу спрямованого на отримання форм пшениці з низьким вмістом амілози. Спосіб здійснюється таким чином. 1. Виділення ДНК. Фрагмент листа розміром 1см в пробірці типу "епендорф" (1,5мл) гомогенізувати скляним пестиком до повної мацерації тканин та додати 0,5мл лізуючого буферу. Буфер для виділення ДНК містить: 1,4М NaCl, 20mM NasEDTA, 100mM тріс-НСl рН 8,0 при 25°С, 2% 4 СТАВ. Лізат інкубувати 60хв при 60°С. Далі обробити лізат рівним об'ємом суміші хлороформізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішати на вертексі до утворення білої емульсії. Отриману суміш центрифугувати протягом 5хв при 14000об./хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Після центрифугування відібрати водну фазу і перенести у чистий епендорф, додати рівний об'єм ізопропилового спирту та витримувати протягом 10хв за кімнатної температури. Суміш перемішати, ДНК висадити центрифугуванням при 14000об./хв протягом 4хв на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осад промити двічі 70% етанолом, підсушити при кімнатній температурі та розчинити у ТЕ-буфері (1 мкМ NasEDTA, 10mM тріс-НСl рН 8,0). Концентрацію виділеної ДНК визначити на флюориметрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" ("Hoefer Scientific Instruments", США) у 1xTNE буфері (3М NaCl, 50mM Na 2HPО4) у присутності флюорісцентного барвника Hoechst 33258 згідно інструкції користувача обладнання. 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Реакційна суміш для проведення ПЛР обсягом 20-25мкл містить: 10хПЛР буфер (3М КСl, 2М Тріс-НСl рН 8,4 (25°С), 10% Tween-20), ДНК 40нг, 1,5-2,0mM MgCl2, 10 pmol кожного праймера (прямого та зворотного) (табл.1), по 0,2mM кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, та 1-1,5од. ДНКполімерази Taq. Поверх реакційної суміші нашарувати 25мкл мінеральної олії "Bajol F". Режим ампліфікації наступний: перша денатурація - 94°С - 1хв 30сек; наступні 35 циклів денатурація 94°С - 1,0хв, реасоціація: 55°С-65°С, залежно від праймерів, на протязі 40сек, елонгація при 72°С - 1,0хв; заключна елонгація: 72°С - 2хв. Таблиця 1 Пари праймерів для детекції алельного стану за Wx-локусами Назва праймерів AFC AR2 Wx98F1 Wx98R1 WxD1b1F WxD1b1R WMC 262 Локус Wx-A1 (7AS) Wx-B1 (4AL) Wx-D1 (7DS) Wx-B1 (4AL) Послідовність праймерів (5'-3') TCGTGTTCGTCGGCGCCGAGATGG CCGCGCTTGTAGC AGTGGAAGTACC TCCTCCTCCTTCCTGCCAATTCC TCACCACCTTCTTCACGTCG AC AGGATCTCTCCTGGAAG GCAAGGAAAATAGTGAAGC GCTTTAAC AAAGATCC AAGTGGC AT GTAAACATCCAAAC AAAGTCGAAGG 3. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Для ідентифікації алельного складу досліджуваних Wx-генів продукти ПЛР фракціонували у 10% денатуруючому (8М сечовина) поліакриламідному гелі, розміром 20х20 (1 гель - 30 зразків) в 1хТВЕ-буфері (89,0mM тріс, 89,0mM борна кислота, 2,0mM NasEDTA) за постійної напруги 550В 2-3 години залежно від довжини фрагментів ампліфікації. 4. Візуалізація продуктів ампліфікації. Поліакриламідні гелі фарбувати сріблом відповідно до методики: поліакриламідний гель покласти на 510хв у 10% етанол, потім перенести у 1% НNО3 на Оптимальна t° відпалювання Літературне джерело 65 [1] 55 [3] 55 [3] 60 [3] 3хв. Гель кілька разів промити дистильованою водою. Витримати протягом 20хв у 0,012М AgNO3 у темряві. Двічі промити дистильованою водою. Залити гель відновлюючим розчином (0,28М Na2CO3 (безводний), 0,019% формальдегід), інкубувати, перемішуючи до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Потім промити кілька разів дистильованою водою і покласти у 10% оцтову кислоту на 2хв. На завершення добре промити Н2О. Гель зберігати між двома шарами прозорої поліетиленової плівки. 5. Документування результатів аналізу. Для документування результатів електрофорезу вико 5 37137 ристовувати систему відеодокументування "Image Master YDS". Цифрове зображення забарвлених гелів за допомогою програмного забезпечення "Liscap" перенести на комп'ютер. Розміри ампліфікованих фрагментів визначити, використовуючи програму "Image Master ID Elite". Калібрування молекулярної ваги здійснювати з використанням стандартів молекулярної ваги (pGem, pBlu Script). 6. Спектрофотометричне визначення вмісту амілози в зерновому крохмалі селекційного матеріалу пшениці. Зразки для аналізу готували наступним чином: до 1мг крохмалю додавали 50мкл дистильованої води та 50мкл 2М розчину NaOH. Суміш інку бували протягом 3 годин при 37°С. Додаванням 900мкл 0,11 М оцтової кислоти рН желатинізованого розчину доводили до 6,2-6,4 (рН контролювали за допомогою тестерних смужок). Аліквоту 40мкл даного розчину нейтралізували додаванням 960мкл комбінованого розчину 0,0083% КІ + 0,0083% І2 [11]. Спектральні дані отримували на спектрофотометрі в режимі повного сканування в діапазоні 350...800нм з кроком 1нм. Формою первинного представлення даних була абсорбція (А). Дані імпортували до електронних таблиць Microsoft Excel і там піддавали подальшій обробці. Першу похідну абсорбції (d'A) для окремих точок спектру визначали за формулою d'А=A(λi+Δ/2)-А(λі-Δ/2) де λi - довжина хвилі в точці і; Δ - база взяття похідної = 20нм Параметри багатовимірної лінійної регресії визначали відповідною процедурою у спеціалізованому програмному пакеті Agrobase 21 "Agronomix" (Канада). 7. Приклад конкретного застосування способу для ідентифікації Wx-генотипів в практичній селекції. З рослин родин F3 проводять добір фрагментів листя з одночасним маркуванням окремих рослин, в польових умовах на стадії до колосіння. ДНК виділяють з листя 5 індивідуальних рослин, на кожну родину популяції F3. F3 популяцію одержують за допомогою схрещування контрастних за Wx-генами батьківських форм (Wx-A1a, Wx-B1a, Wx-D1a x Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b). Проводять ПЛР-аналіз виділеної ДНК рослин з праймерами до локусів Wx-A1, Wx-B1, Wx-D1. Продукти ампліфікації фракціонують у 10% денатуруючих (8М сечовина) поліакриламідних гелях, забарвлюють та встановлюють розмір ПЛР-продуктів відносно стандартів молекулярної ваги, використовуючи вище зазначені рекомендації. На доріжках гелю мають чітко детектуватися після електрофорезу продуктів ПЛР: з парою праймерів AFC/AR2 фрагмент ДНК вагою 389 п.н. (алель Wx-A1d) або нульалель (Wx-A1b) з молекулярною вагою 370п.н.; з парою праймерів Wx98 F/R амплікон розміром 308 п.н. (Wx-B1a) чи відсутність зазначеного фрагменту - нуль-алель; з парою праймерів WxD1b1 F/R фрагмент ДНК з молекулярною вагою 775п.н. (нуль-алель Wx-D1a) або алель Wx-D1b вагою 280п.н. [12]. В разі виявлення нуль-алеля (відсутність фрагменту) за Wx-B1 локусом для контролю 6 чіткої наявності нуль-алеля, нами пропонується використати пару праймерів WMC 262 (амплікон розміром 170п.н. (Wx-B1a), фрагмент ДНК вагою 210 п.н. (Wx-B1b)). Проводять добір гомозиготних рослин F3 з алелями Wx-A1b, Wx-B1b, Wx-D1b. Врожай зерна F4, отриманий від рослин F3 висівають в полі. В наступному році знову проводять добір матеріалу (по 3 індивідуальні рослини) для ПЛР-контролю Wx-генів. Кількість матеріалу відібраного з популяції F4 в середньому складає 100200г (1 родина), що є недостатнім для проведення подальших те хнологічних тестів з якості зерна. Нами пропонується проводити спектрофотометричну оцінку вмісту амілози [11] та вимірювання індексу Хагберга, використовуючи матеріал добраний в F3 поколінні. Таким чином, ПЛР-аналіз з маркерами до Wxлокусів геному м'якої пшениці та спектрофотометрична оцінка вмісту амілози може застосовуватись в генетико-селекційних дослідженнях для підвищення ефективності та контролю селекційного процесу при створенні форм з низьким або нульовим вмістом амілози. Список літератури: 1. Nakamura Т., Vrinten P., Saito M., and Konda M. Rapid classification of partial waxy wheats using PCR-based markers. // Genome. - 2002. - № 45. P.1150-1156. 2. Graybosch R., Souza E., Berzonsky W. Functional properties of waxy flours: genotypic and environmental effects. // Cereal Science. - 2003. №38. - P.69-76. 3. McLauchlan A., Ogbonnaya F.C., Hollingsworth B. et.al. Development of robust PCRbased DNA markers for each homoeo-allele of granule-bound starch synthase and application in wheat breeding programs. // Aust. J. Agric. Res. 2001. - №52. - P.1409-1416. 4. Кіm W., .Johnson J., .Graybosch R., Gaines C. Physicochemical properties and end-use quality of wheat starch as a function of waxy protein alleles. // Cereal Science. - 2003. - №37. - P.195-204. 5. Черных В.Я., Ширшико М.А. Оценка качества крахмалосодержащего сырья на приборе амилотест АТ-(ЧП-ТА). 2006. http://ipapk.ru 6. Рибалка O.I,. Червоніс М.В, Топораш І.Г. Пшениця ваксі з унікальними властивостями крохмалю: можливі напрямки її використання. // Зберігання та переробка зерна. - 2005. - №7-73. - С.2428. 7. Delwiche S.R, Graybosch R.. Identification of Waxy wheat by near-infrared reflectance spectroscopy // Cereal Science. - 2002. - №35. P.29-38. 8. Foley W.J., Mcllwee A., Lawler I. Ecological applications of near-infrared reflectance spectroscopy a tool for rapid, cost-effective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. // Oecologia. - 1998. - №116. - P.293-305. 9. Fujita Naoko, Hasegawa Hiroshi, Taira Tomoaki. The isolation and characterization of a Wx mutant ofdiploid wheat (Triticum monococcum L.) // Plant Science. - 2001. - №160. - Р.595-602. 10. Петрова И.В., Чеботарь С.В., Рыбалка 7 37137 А.И., Сиволап Ю.М. Идентификация Wx генотипов среди сортов озимой мягкой пшеницы // Цитология и генетика. - 2007. - т.41. - №6. с.11-17. 11. Петрова І.В., Хо хлов О.М., Чеботар С.В., Рибалка O.I., Сиволап Ю.М. Оптимізація спектрофотометричного визначення вмісту амілози в зерновому крохмалі селекційного матеріалу пшениці // Зб. наук. пр. СП - 2007. №9(49). - с.140-149. Комп’ютерна в ерстка А. Рябко 8 12. Петрова И.В., Чеботарь С.В., Рыбалка A.M., Сиволап Ю.М. Контроль Wx-генов в процессе селекции при создании форм мягкой пшеницы с нулевым и низким содержанием амилозы // Зб. науч. тр. "Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии", Алушта, 2007, т.1. с.162164. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601