Спосіб виділення комплексу дестабілаза-простаноїд з медичної п`явки
Номер патенту: 37241
Опубліковано: 15.05.2001
Автори: Селезньов Констянтин Георгієвич, Ніконов Гєннадій Івановіч
Формула / Реферат
1. Способ выделения комплекса дестабилаза-простаноид из медицинской пиявки, включающий очистку обработанного сырья путем аффинной хроматографии, элюирование буферным раствором, нейтрализацию элюата с последующей лиофильной сушкой, отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят на возвратных колонках SILASORB CB, а элюирование - органическими растворителями.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят на антитела 6-кето-простагландин F, иммобилизированные на водонерастворимом носителе.
Текст
Изобретение относится к медицине и может применяться в биохимии, гематологии, медицине и медицинской промышленности. Известен способ получения дестабилазы из пиявки, взятый нами в качестве прототи па, включающий аффинную хро матографию на L-лизине, иммобилизированном на водонерастворимом носителе, элюцию целевого продукта, нейтрализацию элюата и лиофи лизацию. В качестве сырья используют секрет слюнных желез пиявок, порошок лиофильно высушенных пиявок и экстракт из культуры бактерии-симбионта медицинских пиявок. Однако данный способ имеет следующие недостатки: конечный продукт не является гомогенным препаратом, т.к. содержит в своем составе гирудин и ингибитор калликреина. Не вся дестабилаза связывается с L-лизином, до 50% ее активности определяется в проскоке, т.е. в несвязавшейся части исходного раствора с лизином, иммобилизированном на водорастворимом носителе. В основу изобрете ния поставлена задача создания способа выделения комплекса деста билаза-простаноид из медицинской пиявки, в котором обеспечивается уве личение выхо да конечного продук та и повышение его чистоты. Поставленная задача решается тем, что в спо собе выделения комплекса деста билаза-простаноид из медицинской пиявки, содержащем очистку обработанного сырья путем аффинной хроматографии, элюирование буфер ным раствором, нейтрализацию элюата с последующей лиофильной сушкой, согласно изобретению аффинную хроматографию прово дят на возвратных колонках SILASOBS C8, а элюирование – органическими растворителями или на антитела 6-кето-простагландин F, иммобилизированные на водонерастворимом носителе. Способ осуществляют следующим образом. По п.1 формулы изобретения аффинную хроматографию проводят на сорбенте SILASORB C8, элюируют свя зывающуюся с сорбентом деста билазу органическими растворителями. Полученные элюаты упаривают до сухого остатка. Приводим примеры осуществления способа. Пример 1. На колонку, наполненную сорбентом SILASORB C8 (1,5 х 4 см) наносили 10 мл секрета слюнных желез пиявок. Промывали дистиллированной водой от несвязывающей части секрета пиявок. Элюировали 40 мл 100% метанола. Элюат упаривали в роторном испарите ле, растворяли в 0,5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 6,8. Определяли содержание и активность дестабилазы, пиявочных простагландинов, гирудина и ингибитора калликреина плазмы крови. Конечный продукт со держит дестабилазу, простаноид. Анализ несвязавшейся части секрета пиявок с сорбентом показал полное отсутствие активности дестабилазы и простаноида, т.е. произошло 100% связывание дестабилазы с сорбентом (табл. 1). Пример 2. Водный экстракт культуры бактерии-симбионата медицинской пиявки в объеме 20 мл наносили на колонку с сорбентом SILASORB C8. Далее все процедуры, как в п.1, только в качестве элюирующе го раствора использовали этилацетат. Полученный препарат дестабилазы соответствует целевому продукту (табл.1.). Пример 3. Водный экстракт порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок в объеме 40 мл наносили на колонку, на полненную сорбентом SILASORB C8. Да лее, как в п.1, только элюцию проводили 50% метанолом в дистиллированной воде в количестве 80 мл. Полученный препарат дестабилазы соответствуе т це левому продукту (табл.1.). Пример 4. Все процедуры, как в п.1, только элюцию проводили дистиллированной водой, затем 0,05 М трис-HCl, буфером рН 3,5. В этом случае не удается элюировать связавшуюся с сорбентом деста билазу. Приводим примеры осуществления способа по п.2 формулы изобрете ния. Пример 1. Лиофилизированную антисыворотку к 6-кето-ПГF иммобилизовывали на бромцианактивированную агарозу. На колонку наносили 5 мл водного экстракта лиофильно высушенных пиявок (система рециклина в течение 2 часов). Промывали колонку дистиллированной водой. Элюировали целевой продукт буфером, содержащим 0,2 М глицина, 0,15 М HCl рН 3,0. Собранные фракции подщелачивали 0,1 Н NaOH до рН 8,0. Объем элюата 8,5 мл (белок 0,03 мг/мл). Элюат диализовали против дистиллированной воды в течение 48 часов при 4оС через мембрану с порами размером 2000 Да, после чего лиофи лизовали. Полученный препарат соответствует це левому продукту, обладает фибринолити ческой активностью, содержит простагландины и обладает активностью гирудина и ингибитора калликреина плазмы крови. При электрофорезе проявляется в виде доминантной полосы, соответствующей белку с ММ 12,3 кДа (табл.2). Пример 2. Все процедуры, как в п.1, только в качестве сырья использовали секрет слюнных желез пиявок в количестве 5 мл, а элюирующе го буфера – раствор уксусной кислоты с рН–4,0. Полученный препарат соответствует це левому продукту (табл. 2). Пример 3. Все, как в примере 1, только в качестве сырья использовали водный экстракт культуры бактерии-симбиона медицинских пиявок, а элюирующего раствора - раствор уксусной кислоты с рН 3,5, содержащий 0,2 М гли цина. Полученный препарат соответствуе т целевому продукту. Пример 4. Все, как в примере 1, только в качестве элюирующе го буфера использовали раствор уксусной кислоты с рН 5,0. Активность снижена на 80%. Полученный препарат не соответствует це левому продукту, т.к. полной элюции не произошло. Ме тоды определения. 1. Спектрофотометрический метод определения белка (Кочетов Г.А. Практическое руководство по экзимологии. М., Высшая школа, 1971 г.). 2. Активность гирудина определяли по удлинению тромбинового времени и выражали в международных ATNIH еди ницах. Активность ингибитора калликреина плазмы крови анализировали по удлинению вре мени рекальцифи кации плазмы крови и выражали в условных антипрокоагулянтных единицах (Кудряшов Б.А. Большой практикум по физиологии человека и животных. М., Высшая школа, 1984 г.). 3. Содержание простагландинов анализировали по прописи фирмы Amersham (США) с использованием радиоиммунологического метода определения 6-КЕТО-P F. 4. Электрофорез проводили в системе Лемли в ПААГ в де котурирующи х условиях. 5. Фибринолитическую активность определяли по размеру зон лицина на пластинах стабилизированного фибрина (3). Предлагаемый способ позволяет получить конечный продукт с более высокой частотой и в большем объеме. Таблица 1 Ха рактеристика дестабилазы, полученной по предлагаемому способу и способу-прото типу Параметр определения Прототип Примеры 1 2 3 4 Активность дестабилазы (мм/мг) 24 54 58 53 0 Содержание простогландинов (наногр/мг) 600 1750 1800 1620 0 Активность гирудина (ATNIH Un/mg) 50 0 0 0 0 Активность ингибитора калликреина (АПК Ед/мг) 46 0 0 0 0 Выход целевого продукта (%) 45 100 100 100 0 Наличие полос на электрофо рограммах образце дестабилазы 50 12,3 25 6 12,3 12,3 12,3 0 6 Таблица 2 Ха рактеристика дестабилазы, полученной по предлагаемому способу и способу-прото типу Параметр определения Прототип Примеры 1 2 3 4 Активность дестабилазы (мм/мг) 24 60 55 58 8 Содержание простогландинов (наногр/мг) 600 1500 1350 1620 100 Активность гирудина (ATNIH Un/mg) 50 0 0 0 0 Активность ингибитора калликреина (АПК Ед/мг) 46 0 0 0 0 Выход целевого продукта (%) 45 0 0 0 0 Наличие полос на электрофо рограммах образце дестабилазы 50 12,3 25 6 12,3 12,3 12,3 12,3 6 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for isolating destabilase-prostanoid complex from medicinal leech
Автори англійськоюSelezniov Kostiantyn Heorhiiovych, Nikonov Hennadii Ivanovych
Назва патенту російськоюСпособ выделения комплекса дестабилаза-простаноид из медицинской пиявки
Автори російськоюСелезнев Константин Георгиевич, Никонов Геннадий Иванович
МПК / Мітки
МПК: A61K 35/62
Мітки: п`явки, виділення, комплексу, медичної, спосіб, дестабілаза-простаноїд
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/4-37241-sposib-vidilennya-kompleksu-destabilaza-prostanod-z-medichno-pyavki.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виділення комплексу дестабілаза-простаноїд з медичної п`явки</a>
Попередній патент: Спосіб моделювання асоційованої форми кандидо-герпетичної інфекції
Наступний патент: Обмежувач струму при змінній напрузі
Випадковий патент: Спосіб укладки чавунних муфтових труб і установка для його здійснення