Спосіб отримання біологічного інсектицидного препарату мерівал

Спосіб отримання біологічного інсектицидного препарату Мерівал, що включає збір гусениць з рослин аґрусового п'ядуна, який відрізняється тим, що з насаджень ягідників проводять збір гусениць 4-го віку аґрусового п'ядуна (Abra xas grossulariata Z), утримують їх без їжі в лабораторних умовах впродовж 24-36 годин, крім того, впродовж 4,5-5,0 годин витримують гусениці за температури 35±2°С, розміщують їх у марлеві садки за температури 21±2°С та відносної вологості повітря 3 38207 Відомий також спосіб отримання вірусного інсектицидного препарату у формі сухого порошку [Патент США. Вир усная композиция для защиты сельскохозяйственной продукции от насекомых. №5023182, МПК Α01Ν63/00; C12N/00. НКИ 435235. Заявка №212641. Заявлено 28.06.1988; Опубл. 11.06.1991]. Запропонована вірусна композиція для захисту насаджень від комах - сухий порошок, що складається з бакуловірусів. Готується своєрідний субстрат, який вміщує в собі живильний компонент для личинок комах і виконує роль носія інших компонентів, зокрема дріжджів. Композицію гомогенізують у виді. Далі гомогенат висушують і отримують вірусн у композицію. Недоліком відомого способу є те, що висушування композиції супроводжується втратами патогенності діючої речовини та її ефективності. Відомий також спосіб отримання інсектицидного препарату на основі ентомопатогенного вірусу, який є найбільш близьким технічним рішення до способу, що пропонується і вибраний в якості найближчого аналога [Кочерга М.О., Дрозда В.Ф. Спосіб отримання вірусного інсектицидного препарату Вірин MB. Патент України №33254, МПК A01N63/00. Опубл. 10.06.2008; Бюл. №11]. Спосіб, викладений у найближчому аналозі полягає у тому, що з насаджень аґрусу проводять збір гусениць 3-4-го віків аґрусового п’ядуна (Abraxas grossulariata Ζ), утримують без їжі в лабораторних умовах одну добу і витримують 3,5-4 години за температури 35±2°С. Проводять процедуру інфікування гусениць вірусом ядерного поліедрозу з титром 105 поліядрів/млн., шляхом згодовування гусеницям листя аґрусу. Після загибелі гусениць, їх подрібнюють, причому, на кожні 50мг біомаси задають по 0,5л води, фільтрують центрифугують і вибирають вірусні суспензію і готують препарат Вірин MB у такому співвідношенні компонентів, мас, %: вірусна суспензія-0,6-0,9; гліцерин - 42,443,5; шлам-12,0-15,0; вода - решта. Реалізація способу дозволила отримати вірусний інсектицидний препарат Вірин MB з вираженими інсектицидними характеристиками. Проте, спосіб найближчий аналог має такі недоліки: не досить виражена інсектицидна дія по відношенню до гусениць аґрусового п’ядуна, через присутність у складі препарату лише однієї діючої речовини - вірусу ядерного поліедрозу (ВЯП); така характеристика, як вірулентність ВЯП ніяк не перевищує показник норми реакції збудника ВЯП. В основу корисної моделі поставлене завдання експериментально обгрунтувати спосіб отримання біологічного інсектицидного препарату Мерівал на основі ентомопатогенних вірусів, котрий вміщує у собі дві діючі речовини: вірус ядерного поліедрозу (ВЯП) та вірус гранульозу (ВГ). Ставилось також завдання отримати препарат з вираженими токсикологічними характеристиками, безпечний для теплокровних та корисних видів комах. Поставлене завдання вирішувалось тим, що у способі отримання біологічного інсектицидного препарату Мерівал, що включає збір гусениць з рослин аґрусового п'ядуна, згідно корисній моделі, з насаджень ягідників проводять збір гусениць 4-го віку аґрусового п’ядуна (Abraxas grossulariata Z), 4 утримують їх без їжі в лабораторних умовах впродовж 24-36 годин, крім того, впродовж 4,5-5,0 годин витримують гусениці за температури 35±2°С, розміщують їх у марлеві садки за температури 21±2°С та відносної вологості повітря 78,0±5,0% і згодовують гусеницям листя ягідників, попередньо інфіковане природними штамами вірусу гранульозу та вірусу ядерного поліедрозу у співвідношенні 1:1 з титром 105 поліядрів/мл., крім того, після масового прояву збудників хвороби гусениць та їх загибелі їх подрібнюють, розтирають у ступці, при чому, на кожні 50мг біомаси додають по 0,5л води, фільтрують через марлю та розливають у пробірки об’ємом 15-20мл, центрифугують 10-12 хвилин за 9-10тис. обертів/хвилину, відбирають вірусну суспензію - вірус гранульозу та вірус ядерного поліедрозу у співвідношенні 8:1 і готують біологічний препарат Мерівал у такому співвідношенні компонентів, мас, %: вірусна суспензія - 0,7-0,9; гліцерин - 42,4-43,5; лактоза - 12,0-15,0; вода-решта. Для отримання біологічного інсектицидного препарату Мерівал, в якості діючої речовини використовується бінарна суміш природних популяцій вірусу гранульозу (ВГ) та вірусу ядерного поліедрозу (ВЯП) у співвідношенні 8:1. Крім того, у складі біологічного препарату Мерівал є допоміжні компоненти - гліцерин та лактоза, як наповнювачі та протектанти. Суть запропонованого способу полягає у тому, що використовують для практичних проблем захисту рослин таку природну закономірність, як здатність популяцій гусениць аґрусового п’ядуна, внаслідок дії стресових факторів масово уражуватись збудниками хвороб, зокрема, вірусних. Внаслідок візуального моніторингу, виявили окремі осередки гусениць пуна, збирали інфікованих гусениць, переносили в умови лабораторії і отримували природний штам збудника хвороби. Спонтанні вірози відносяться до двох збудників - гранульоз та ядерний поліедроз. Проведені нами спеціальні дослідження виявили різні типи концентрації в тканинах жирового тіла гусениць збудників вірозів. ВГ розвивається у цитоплазмі ядер тканин та гіподермі, ВЯП скупчується в ядрах клітин жирової тканини та гіподермі. Віруси відрізняються за морфогенезом. Обидва штами вірусів гетерогенні і відрізняються за розмірами. Дослідження показали відсутність антагоністичних відношень між вірусами в тканинах та клітинах. Внаслідок багаторазової реплікації вірусів ВГ та ВЯП разом в одних тканинах та клітинах, обидва віруси розвиваються нормально. Вібріони обох вірусів не зазнають змін, зберігаючи при цьому традиційну стр уктур у. Приклади здійснення способу. Приклад 1. Насадження аґрусу та чорної смородини, на куща х яких розводили та збирали гусениць аґрусового п’ядуна. Інфікування гусениць 4-го віку проводили ВГ та ВЯП, а також сумішшю. Віруси вносили через корм. Розрахунок ЛД50 для гусениць 4го віку проводили за методом пробитів та рівнянню регресії, а термін ЛЧ50 розраховували експериментально після загибелі 50% інфікованих гусениць. Діагностику загибелі інфікованих гусениць 5 38207 проводили у світло вому, фазово-контрастному мікроскопі. Вірусний біоматеріал попередньо очищали від залишків тканин, гомогенізували. ВГ та ВЯП виділяли методом диференційного центрифугування. Підрахунок поліядрів проводили у камері Горяєва. Безпечність бакуловірусів для корисної ентомофауни оцінювали по відношенню до найбільш поширених видів паразитичних та хижих комах. 6 Для обгрунтування специфічності сумісної дії суміші дво х діючи х речовин - ВГ та ВЯП проводили спеціальні дослідження, в яких враховують певне кількісне співвідношення ВГ та ВЯП. Результати порівнювали з дослідами з моно інфекцією ВГ та ВЯП. В умовах лабораторних дослідів заражали вірусами та їх сумішшю гусениці аґрусового п'ядуна, обґрунтовуючи визначальний суттєвий елемент способу. Результати досліджень наведено у таблиці 1. Таблиця 1 Тривалість інфекційного процесу у гусениць II та ІІІ-го віків аґрусової вогнівки (температура 24±2°С) Варіант ВГ ВЯП ВГ+ВЯП ВГ ВЯП ВГ+ВЯП ВГ ВЯП ВГ+ВЯП НІР05 Вік гусениць II II II II II II III III III Титр збудника Загинуло гусевірозів на гуниць, % сеницю 3 10 79,6 103 75,1 103 95,2 ю5 88,6 105 89,4 105 98,4 89,3 2´105 71,4 2´105 96,5 2´105 2,8 Встановлено, що внаслідок інфікування гусениць сумішшю двох вірусі в (елемент способу), рівень смертності гусениць підвищується і прискорюється патогенна дія вірусів. Інкубаційний період захворювання скорочується на 2-6 днів. Значно знижується доза ЛЧ50. Підтверджено синергетичний характер взаємодії вірусів. Значення ЛЧ50 вірусів знижується зі зменшенням віку популяцій. Приклад 2. Обґрунтовували величину оптимального вмісту діючої речовини та супутні х компонентів у скла Період часу, що виникає загибель гусениць, днів ЛЧ50 ЛЧ80 ЛЧ100 8 12 10 13 7 9 11 9 11 8 10 6 8 9 10 12 10 11 8 9 2,4 2,1 ді препарату на основі оцінки визначальних тестових характеристик. Було передбачено три варіанти з вмістом вірусу від 0,5 до 0,9мас.%. Відповідно був вміст інших компонентів у складі препарату. Підсумкову оцінку порівнювали із показниками способу - найближчого аналога. Встановлено, що найбільш ефективна дія препарату Мерівал спостерігалась, коли співвідношення компонентів у складі препарату становила, мас. %: вірусна суспензія ВГ та ВЯП - 0,7-0,9; гліцерин - 42,4-43,5; лактоза - 12,0-15,0; вода - решта. Таблиця 2 Експериментальне обґрунтування способу отримання біологічного препарату Мерівал Способи та варіанти, що порівнюються 1 Спосіб, що пропонується: вірусна суспензія ВГ та ВЯП - 0,9; гліцерин - 43,5; лактоза - 15,0; вода - решта, мас. % (оптимальні режими) Спосіб, що пропонується: вірусна суспензія ВГ та ВЯП - 0,7; гліцерин - 42,4; лактоза - 12,0; вода - решта, мас. % (оптимальні режими) 2 Довірчі інтервали, % 3 ЛЧ50, дні 4 Довірчі інтервали, дні 5 0,04 0,02-0,03 5,2 0,03 0,02-0,04 5,0 ЛК50, % 6 Ё´90 Ё´50 7 4,9-8,0 7,5 1,44 4,6-7,7 8,6 1,72 ЛК90 7 38207 8 Продовження таблиці 2 1 Спосіб, що пропонується: вірусна суспензія ВГ та ВЯП - 0,5; гліцерин - 40,2; лактоза - 17,0; вода - решта, мас. % (оптимальні режими) Спосіб найближчий аналог НІР05 2 3 4 5 6 7 0,18 0,09-0,19 12,1 10,3-19,1 21,2 1,75 0,18 0,12-0,75 19,0 2,5 12,7-22,3 4,1 42,4 2,4 Приклад 3. Складова частина способу, тобто екологічні наслідки використання препарату Мерівал - його безпечність по відношенню до природних популяцій ентомофагів. Наведений приклад - ілюструє одну із характеристик позитивного результату способу. Перш за все, досліджували фі тотоксичність складових частин препарату бакуловірусів ВГ та ВЯП, а також препарату Мерівал по відношенню до листя ягідників - чорної смородини, аґрусу, малини, нектароносних рослин, візуально за наявності опіків, або їх ознак на рослинах після використання препарату через 1 годину та 24 години. В усі х дослідах впродовж трьох років спостережень на рослинах не відмічалось випадків опіку рослин. Оброблене листя нормально розвивалось та функціонувало після використання препарату Мерівал або його складових компонентів. Підсумки проведених досліджень показали відсутність фітотоксичної дії препарату Мерівал. Безпечність бакуловірусів та препарату перевірили на лабораторних тестови х об'єктах комах, для чого використовували найбільш поширених ентомофагів - паразитів та хижаків. В польових умовах після використання препарату спостерігали післядію по відношенню до ентомофагів. Результати досліджень наведено у таблиці 3. Таблиця 3 Експериментальне обґрунтування рівня чутливості експериментальної інфекції бакуловірусів аґрусового п'ядуна Abraxas grossulariata Стадія розвитку гусениці Титр діючої речовини 104 Zophodia convolutella імаго 104 імаго імаго імаго імаго імаго личинка личинка імаго личинка імаго 106 107 107 107 107 107 107 107 107 107 Види комах у досліді Trichogramma pintoi Cocconella septempunctata Habrobracon hebetor Apanteles laevigatus Macrocentrus marginator Syrphus corolla Chrysopa carnea Anthocorіs nemorum Forficula auricularia Dibrachus cavus Встановлено, що тільки по відношенню до двох видів шкідливих комах - аґрусового п'ядуна та аґрусової вогнівки препарат проявив виражену токсикологічну дію. Спостерігались процеси природної реплікації ВГ та ВЯП в гусеницях шкідників, що стало причиною їх загибелі. Препарат був безпечним по відношенню до популяцій ентомофагів. Комп’ютерна в ерстка С.Литв иненко Інкубаційний Прояв інфекції період, діб 6-8 Процеси природної реплікації ВГ та ВЯП, що супроводжу6-8 ється загибеллю 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається 6-8 Зараження не відбувається Таким чином запропоновано спосіб отримання біологічного інсектицидного препарату Мерівал, досить ефективного для цільових шкідників ягідників, безпечного для рослин та популяцій ентомофагів. Препарат може бути використано в технологіях інтегрованого захисту ягідників від шкідників. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601