Спосіб гістологічного фарбування

Спосіб гістологічного фарбування, у якому гістологічні зрізи різних тканин організму фіксують у рідині, поміщують у парафін, далі гістологічні зрізи депарафінують, промивають у дистильованій воді та послідовно фарбують до виразної появи ядер, цитоплазми та сполучної тканини, який відрізняють тим, що як рідину, якою фіксують гістологічні зрізи, використовують 10% розчин формаліну, а ядра, при послідовному фарбуванні гістологічних зрізів, фарбують гемалуїном Майєра, виготовленим за стандартною методою. (19) (21) u200808994 (22) 09.07.2008 (24) 10.02.2009 (46) 10.02.2009, Бюл.№ 3, 2009 р. (72) КОПИЦЯ МИКОЛА ПАВЛОВИЧ, U A, ЯКОВЦОВА АНТОНІНА ФЕДОРІВН А, U A, ШАПКІН АНТОН СЕРГІЙОВИЧ, UA, МАРКОВСЬКИЙ ВОЛОДИМИР ДМИТРОВИЧ, U A, ГАРГІН ВІТАЛІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ, U A, ГОЛЬЄВА Н АТАЛІЯ ВОЛОДИМИРІВН А, U A, КАТМІСЬКА ЕЛЕОНОРА ВОЛОДИМИРІВН А, U A (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ТЕРАПІЇ ІМ. Л.Т. МАЛОЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ Н АУК УКРАЇНИ", UA 3 39109 ній воді протягом 24-48 годин, виготовляють зрізи товщиною 5-7мкм, депарафінують зрізи, промивають в дистильованій воді, занурюють у 0,1% розчин азокарміну G. Фарбують у добре закритій посудині у термостаті при 56-60° протягом 45-60 хвилин, а потім охолоджують при кімнатній температурі. Ополоскують у дистильованій воді й диференціюють у 0,1% спиртовому аніліновому розчині до виразної появи ядер (під контролем мікроскопа). Змивають анілін 1% оцетокислим спиртом 0,51 хвилину. Протравлюють сполучну тканину в 5% водному розчині фосфорновольфрамової кислоти протягом 1-3 годин. Ополоскують у дистильованій воді 1 хвилину й офарбовують у розчині анілінового синього-оранжевому - оцтовій кислоті 1-3 години. Промивають у воді, диференціюють в 96° спирті, потім занурюють у карбол-ксилол - 5 хвилин, ксилол - 5 хвилин, полістирол. Результати фарбування: сполучна тканина різко синя, ядро червоне, цитоплазма кліток різних тканин червонувата до оранжевої. Достойністю даного способу фарбування є його стійкість та гарний контраст кольорів між синьою сполучною тканиною й цитоплазмою від червоної до оранжевої. Недоліками відомого способу є його тривалість, що зумовлено надзвичайно довгим промивання матеріалу у воді після фіксуючих сумішей, час самого фарбування триває за мінімальними підрахунками від 4,5 годин до 8 годин за максимальними підрахунками, що змушує лаборанта витрачати велику кількість часу свого робочого дня. Крім цього близькість кольорової гами фарбування ядра й цитоплазми не дозволяє чітко розрізняти дані структури. Відомий також спосіб гістологічного фарбування, запропонований Маллорі для фарбування сполучної тканини та паренхіми. [Основы цитологической диагностики и микроскопическая техника: Учебное пособие для ВУЗов / Н.Ю. Полонская, О.В. Егорова. // М.: Издательский центр "Академия". - 2005. - 160с., Б. Ромейс Мікроскопічна техніка. Москва. Видавництво іноземної літератури. 1953. - С.352]. Даний спосіб фарбування є найбільш близьким за технічною сутністю й результатами до способу, що заявляється, тому він обраний за прототип. Суть прототипу полягає в тім, що шматки тканин фіксують у рідині Ценкера або у ценкерформолі за Хеллі - не менш, ніж 24 години, виготовляють зрізи товщиною 5-7мкм, депарафінують зрізи, промивають в дистильованій воді - 0,5 хвилини, офарблюються у 0,1% водному розчині кислотного фуксину - 3 хвилини. Промивають у воді й 1%-ною фосфорномолібденовою кислотою, 3-5 хвилин. Далі промивають у воді - 2 хвилини, офарблюють у розчині анілінового синього - оранжевого - щавлевої кислоти - 3-5 хвилин. Промивають у воді, диференціюють в 96° спирті, потім занурюють у карбол-ксилол - 5 хвилин, ксилол - 5 хвилин, полістирол. Результат фарбування: сполучна тканина темно-синя, цитоплазма від яскраво-оранжевої до 4 червонуватої, ядра від червонуватого до жовтуватого. Достойностями даного методу є простота виконання, доступність реактивів і досить чіткий контраст кольорової гами між синьою сполучною тканиною й червоно-оранжевою паренхімою. Однак, істотним недоліком є те, що для досягнення найкращих результатів при роботі за зазначеною методикою більш за все показана фіксація матеріалу в хромово-сулемових рідинах: рідина Ценкера й ценкер-формол за Хеллі або Максимовим. Але сулема, яка входить до складу цих фіксуючих сумішей, є дуже токсичною речовиною, тому застосування цього способу гістологічного фарбування обмежене. Іншим недоліком даного методу є близька кольорова гама червоно-жовтуватих ядер і оранжевої цитоплазми, що обмежує чіткість та унеможливлює вивчення стану ядра й внутрішньоядерних стр уктур. В основу корисної моделі покладено завдання створити такий спосіб гістологічного фарбування, у якому не змінюючи якість фарбування строми та паренхіми, досягти чіткого контрасту кольорової гами ядер та цитоплазми, що забезпечить можливість більш об'єктивно вивчати морфологічні зміни строми та паренхіми, ядер та додатково внутрішньоядерних структур при різних патологічних станах. Це завдання вирішується у способі гістологічного фарбування, що заявляють, у якому гістологічні зрізи різних тканин організму фіксують у рідині, заключають у парафін, далі гістологічні зрізи депарафінують, промивають у дистильованій воді та послідовно фарбують до виразної появи ядер, цитоплазми та сполучної тканини. Ознаками, що відрізняють корисну модель від прототипу, є: - у якості рідини, якою фіксують гістологічні зрізи різних тканин організму, використовують 10% розчин формаліну; - ядра, при послідовному фарбуванні гістологічних зрізів, фарбують гемалуїном Майєра, виготовленим за стандартною методою. Спосіб гістологічного фарбування тканин, що заявляється, відпрацьовували у Харківському Національному медичному університеті й в ДУ "Інститут терапії ім. Л.Т. Малої АМН України" на зрізах різних тканин людини й тварин (56 експериментів при гістологічному фарбуванні). Саме за даними власних оригінальних досліджень у корисній моделі, що заявляють, завдяки фіксації тканин у 10% формаліні та офарбленням ядра гемалуїном Майєра у сук упності з відомим із прототипу офарбленням сполучної тканини та цитоплазми розчином анілінового синього з оранж G досягається одночасне й диференційоване вивчення ядра, цитоплазми, сполучної тканини та додатково ядерця на основі чітко помітної кольорової гами кожного з перерахованих об'єктів. Переваги способу гістологічного фарбування, що заявляють, у порівнянні з прототипом надаються у таблиці 1 5 39109 6 Таблиця 1 Переваги способу, що заявляється, над відомим №№ п/п Показники, що порівнюються Прототип Спосіб, що заявляється рідина, якою фіксують гісто1. хромово-сулемові суміші 10% формалін логічні зрізи послідовно фарбують до виразної появи ядер, строми та 0,1 % водний розчин кислотного 2. гемалуїн Майєра фуксину паренхіми, при цьому ядро фарбують: 3. колір, у який фарбується ядро червоно-жовтуватий фіолетовий Колір, у який фарбується 4. не розрізняється червоно-оранжевий ядерце Колір, у який фарбується ци5. червоно-оранжевий червоно-оранжевий топлазма відсутній чіткий кольоровий кон- чіткий контраст кольорової гами між ефективність гістологічного траст між ядром та цитоплазмою ядром, ядерцем та цитоплазмою, 6. фарбування та неможливість розрізняти яде- що досягається фарбуванням ядра рце гемалуїном Майєра Ступінь відтворюванності способу гістологічного фарбування - 95%. Спосіб, що заявляється, здійснюється в такій послідовності: Для вивчення морфологічних змін різних тканин організму та їх компонентів (сполучної тканини, цитоплазми, ядра та ядерець), згідно корисній моделі, шматки тканин фіксують у 10% формаліні не менш, ніж 24 години; Заключають їх у парафін. Виготовляють гістологічні зрізи товщиною 5-7мкм, які, далі депарафінують, та промивають в дистильованій воді 0,5хвилини. Згідно корисній моделі Депарафіновані зрізи з дистильованої води переносять у гемалуїн Майєра, офарблюють 3 хвилини; Промивають у водопровідній воді протягом 3 хвилин; Занурюють зрізи в 5% розчин фосфорновольфрамової кислоти на 1 хвилину. Промивають у дистильованій воді - 0,5 хвилини; Офарблюють у розчині анілінового синього й оранж G, оцтової кислоти - 2хвилини. Промивають у дистильованій воді - 0,5 хвилини; Споліскують у 96° спирті, потім занурюють у карбол-ксилол - 5 хвилин, ксилол - 5 хвилин, полістирол. Результат фарбування: сполучна тканина темно-синя; цитоплазма яскраво-оранжева, ядра чітко фіолетові; ядерця червоно-оранжеві; Можливість здійснення запропонованого способу гістологічного фарбування підтверджується прикладами. Приклад 1 Фарбування міокарда людини. Результат: сполучна тканина яскраво-синя, цитоплазма оранжева, ядро фіолетове, ядерце оранжеве (Фіг.1). Приклад 2 Фарбування тканини нирки криси. Результат сполучна тканинна основа гломерул та інтерстиція ярко-синя, мезангій оранжевий, цитоплазма епітелію канальців яскраво-оранжева, ядра фіолетові, ядерця оранжеві (Фіг.2). Приклад 3 Фарбування тканини провідної системи серця людини. Результат: сполучна тканина яскравосиня, цитоплазма оранжева, ядро фіолетове, ядерце оранжеве. Гарно видно вакуолізацію ядра та цитоплазми (Фіг.3). У корисній моделі, що заявляють, завдяки фіксації тканин у 10% формаліні та офарблення ядра гемалуїном Майєра у сук упності з відомим із прототипу о фарбленням сполучної тканини та цитоплазми розчином анілінового синього з оранж G досягається одночасне й диференційоване вивчення ядра, цитоплазми, сполучної тканини та додатково ядерця на основі чітко помітної кольорової гами кожного з перерахованих об'єктів. Даний спосіб є не складним у виконанні, швидким, реактиви недорогими й доступними, а як фіксуюча речовина використовується найпоширеніший 10% формалін, що не впливає на якість фарбування. Даний спосіб дозволяє більш виразно й доступно вивчати морфологічні зміни в тканинах і клітках при різних патологічних станах. 7 Комп’ютерна в ерстка А. Рябко 39109 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601