Спосіб виділення фактора росту нервової тканини з отрути гюрзи

Способ выделения фактора роста нервной ткани из яда гюрзы, включающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гельфильтрацию, ионообменную хроматографию с использованием элюента с повышенной ионной силой, сбор фракций, содержа 39903 значительных затратах времени и реактивов, применение линейного градиента с повышающейся ионной силой, требующего дополнительного оборудования, делает процесс выделения относительно дорогим, а производство низко рентабельным. В основу изобретения поставлена задача разработать способ выделения фактора роста нервной ткани из яда гюрзы, позволяющий путем проведения ионообменной хроматографии в 2 стадии перед гельфильтрацией и применения носителей, обладающих более высокими хроматографическими свойствами и физико-химической стабильностью, повысить рентабельность производственного процесса, сократить время выделения ФРНТ и повысить его чистоту. Поставленная задача решается в способе выделения ФРНТ из яда гюрзы, включающем растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гельфильтрацию, ионообменную хроматографию, сбор фракций, содержащих биологическую активность ФРНТ, и лиофильную сушку, в котором, согласно изобретению, ионообменную хроматографию проводят перед гельфильтрацией и осуществляют ее в две стадии на колонке с носителем соурс 15S, используя на первой стадии в качестве буферного раствора 0,19-0,21 М раствор уксуснокислого натрия с рН 6,4-6,6, и указанный раствор с концентрацией 0,31-0,33 М, в качестве элюента, полученный элюат разбавляют в 4-5 раз дистиллированной водой и повторно хроматографируют на колонке с тем же носителем, но в 10 раз меньшей по объему, используя в качестве буферного раствора 0,0450,055 М раствор уксуснокислого натрия с рН 5,05,2, а в качестве элюента тот же раствор с концентрацией 0,95-1,05 М и рН 6,4-6,6 после чего проводят гельфильтрацию полученного элюата на супердексе G-75 с 0,19-0,21 М раствором бикарбоната аммония при рН 6.4-6,6. Поставленная задача решается предлагаемым способом, когда параметры процесса выделения ФРНТ находятся в пределах, указанных в формуле изобретения. При изменении параметров в сторону увеличения или уменьшения характеристики получаемого препарата ухудшаются. Предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед прототипом: 1. Проведение ионообменной хроматографии в 2 стадии перед гельфильтрацией на колонке с носителем соурс 15S позволяет максимально очистить и сконцентрировать ФРНТ в минимальном объеме, что предполагает использование на стадии гельфильтрации колонки с супердексом G-75 меньшего размера, увеличение скорости элюции и, как следствие, сокращает время производственного цикла с 5-6 суток в прототипе до 22 часов в предлагаемом способе. Кроме того, достигается, как минимум, двухкратное сокращение количества используемых буферных растворов. 2. Физико-химическая стабильность носителей типа соурс 15S и супердекс G-75 гораздо выше, чем у целлюлозы КМ-52 и сефадекса G-100, что позволяет проводить большее количество производственных циклов без заметных изменений характеристик колонки и наряду с сокращением времени выделения и расходных материалов значительно повысить рентабельность производства. 3. Способ применения элюента с повышенной ионной силой требует более простого оборудования, по сравнению с использованием линейного градиента с повышающейся ионной силой, что также повышает рентабельность производства. 4. Предлагаемый способ обеспечивает более высокую степень очистки ФРНТ. Изобретение иллюстрируется примерами 1-3 конкретного осуществления способа и таблицей сравнительных данных способа и прототипа. Пример 1. К 4,0 г яда гюрзы добавляют 80 мл 0,2 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,5, смесь перемешивают 30 минут при 4°С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4°С в течение 15 минут. Осадок выбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют равный объем раствора 0,2 М уксуснокислого натрия с рН 6,5, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0,2 М раствором уксуснокислого натрия (рН 6,5) колонку с соурс 15S (размер колонки 5х3 см, объем - 60 мл). Через колонку пропускают 1.5 л 0,2 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6.5. Скорость нанесения и элюции 30 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV1 (фирма "Pharmacia Biotech''). Основная часть белков (свыше 85%) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 9,2, связывается с соурс 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0,32 М уксуснокислого натрия с рН 6.5. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ собирают (90 мл), разбавляют в 5 раз дистиллированной водой, подводят рН до значения 5,0 и наносят на концентрирующую колонку с соурс 15S (размер колонки 1,6х3 см, объем - 6 мл), уравновешенную 0,05 М раствором уксуснокислого натрия с рН 5,0, со скоростью 300 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма '"Pharmacia Biotech"). Через колонку пропускают 20 мл 0,05 М раствора уксуснокислого натрия с рН 5,0. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе и его элюируют ступенчатым градиентом 0,95 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,5. Весь белковый пик (7,1 мл) собирают и используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят на колонке с супердексом G-75 (2,6х96 см), уравновешенной 0,2 М раствором бикарбоната аммония (рH 6,5). Колонку элюируют 0,2 М раствором бикарбоната аммония со скоростью 10 см/час (50 мл/час). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech"). Белковый пик, содержащий биологическую активность, собирают (26 мл) и высушивают лиофильно. Характеристика препарата: Выход, мг 53.20 мг (1,33% по белку) Выход по активности, % 96,7% Биологическая активность 4,2х10-8г/мл Степень очистки, раз 75,2 Пример 2. К 4,1 г яда гюрзы добавляют 80 мл 0,19 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,4, 2 39903 смесь перемешивают 30 минут при 4°С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4°С в течение 15 минут. Осадок выбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют равный объем раствора 0,19 М уксуснокислого натрия с рН 6,4, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0,19 М раствором уксуснокислого натрия (рН 6,4) колонку с соурс 15S (размер колонки 5х3 см, объем - 60 мл). Через колонку пропускают 1,5 л 0,2 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,4. Скорость нанесения и элюции 30 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech"). Основная часть белков (свыше 85%) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 9,2, связывается с соурс 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0,31 М уксуснокислого натрия с рН 6,4. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ собирают (93 мл), разбавляют в 4,5 раза дистиллированной водой, подводят рН до значения 5,1 и наносят на концентрирующую колонку с соурс 15S (размер колонки 1,6х3 см, объем - 6 мл), уравновешенную 0,055 М раствором уксуснокислого натрия с pH 5,1, со скоростью 300 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма «Pharmacia Biotech»). Через колонку пропускают 20 мл 0,055 М раствора уксуснокислого натрия с pH 5,1. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе и его элюируют ступенчатым градиентом 1,05 М раствора уксуснокислого натрия с pH 6,6. Весь белковый пик (6,9 мл) собирают и используют для гельфильтрации. Гель фильтрацию проводят на колонке с супердексом G-75 (2,6х96 см), уравновешенной 0,21 М раствором бикарбоната аммония (pH 6,6). Колонку элюируют 0,21 М раствором бикарбоната аммония со скоростью 10 см/час (50 мл/час). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech"). Белковый пик, содержащий биологическую активность собирают (24 мл) и высушивают лиофильно. Характеристика препарата: Выход, мг 53,90 мг (1,31% по белку) Выход по активности, % 97% Биологическая активность 4,0х10-8 г/мл Степень очистки, раз 76,1 Пример 3. К 3,9 г яда гюрзы добавляют 80 мл 0,21 М раствора уксуснокислого натрия с pH 6,6, смесь перемешивают 30 минут при 4°С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4°C в течение 15 минут. Осадок выбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют равный объем раствора 0,21 М уксуснокислого натрия с pH 6,6, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0,21 М раствором уксуснокислого натрия (pH 6,6) колонку с соурс 15S (размер колонки 5х3 см, объем - 60 мл). Через колонку пропускают 1,5 л 0,21 М раствора уксуснокислого натрия с pH 6,6. Скорость нанесения и элюции 30 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech"). Основная часть белков (свыше 85%) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 9,2, связывается с соурс 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0,33 М уксуснокислого натрия с рН 6,6. Белковый пик, содержащий активностьФРНТ собирают (86 мл), разбавляют в 4 раза дистиллированной водой, подводят рН до значения 5.0 и наносят на концентрирующую колонку с соурс 15S (размер колонки 1,6х3 см, объем - 6 мл), уравновешенную 0,045 М раствором уксуснокислого натрия с рН 5,2, со скоростью 300 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Рharmacia Biotech"). Через колонку пропускают 20 мл 0,045 М раствора уксуснокислого натрия с рН 5,2. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе и его элюируют ступенчатым градиентом 1,0 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,4. Весь белковый пик (6,8 мл) собирают и используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят на колонке с супердексом G-75 (2,6х96 см), уравновешенной 0,19 М раствором бикарбоната аммония (рН 6,4). Колонку элюируют 0,19 М раствором бикарбоната аммония со скоростью 10 см/час (50 мл/час). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Рharmacia Biotech"). Белковый пик, содержащий биологическую активность собирают (25 мл) и высушивают лиофильно. Характеристика препарата: Выход, мг 52,60 мг (1,35% по белку) Выход по активности, % 96,5% Биологическая активность 4.3х10-8 г/мл Степень очистки, раз 74 Из таблицы следует, что в прототипе производственный цикл рассчитан на 6-дневную рабочую неделю. В предлагаемом способе он составляет менее суток. Это позволяет за равный промежуток времени, используя более простое оборудование, получить более чем в 4 раза больше конечного продукта, что значительно повышает рентабельность производства. Кроме того, степень очистки ФРНТ в предлагаемом способе выше, чем в прототипе, при этом выход по активности практически идентичен. 3 39903 Таблица Сравнительные данные предлагаемого способа и прототипа Сравниваемые параметры Прототип Предлагаемый способ Подготовка яда к хромато4,5 часа 0,8 часа графической очистке *Ионообменная хроматография ≈ 20 часов 5,5 часа **Гельфильтрация ≈ 122 часа 15,4 часа Выход по активности, % 98,1 96,7 Степень очистки, раз 64,1 75,1 Выход продукта, % 1,56 1,33 Биологическая активность 5,3х10-8 г/мл 4,2х10-8 г/мл * - В предлагаемом способе - время, затраченное на обе стадии хроматографии ** - Пересчет на 80% полного объема колонки __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4