Спосіб виділення фактора росту нервової тканини з отрути змії

Способ выделения фактора роста нервной ткани из змеиного яда, включающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гельфильтрацию, ионообменную хроматографию с использованием элюента с повышенной ионной силой, объединение фрак 39983 6,4-6,6) с последующим центрифугированием, гельфильтрацию полученной надосадочной жидкости на Сефадексе G-100 в присутствии того же буферного раствора и ионообменную хроматографию на колонке с карбоксиметилцеллюлозой КМ-52 с использованием линейного градиента с повышающейся ионной силой 0,95-1,05 М уксуснокислого аммония рН 6,4-6,6. Получают препарат ФРНТ с биологической активностью 5х10'8 г/мл и выходом 1,5 % по белку. Однако, использование в пилотном производстве яда одного вида змеи, тем более, если рынок сырья ограничен, а стоимость его достаточно высока, заставляет использовать в качестве дополнительных источников сырья яды других змей, количество и рыночная стоимость которых удовлетворяет широкомасштабное пилотное производство. В основу изобретения поставлена задача разработать способ выделения фактора роста нервной ткани из змеиного яда, позволяющий путем использования в качестве исходного сырья яда щитомордника, проведения ионообменной хроматографии в 2 стадии перед гельфильтрацией и применения носителей, обладающих высокими хроматографическими свойствами и физикохимической стабильностью, расширить ассортимент сырья, получить высокоочищенный ФРНТ и сократить время производства. Поставленная задача решается в способе выделения ФРНТ из змеиного яда, включающем растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гельфильтрацию, ионообменную хроматографию с использованием элюента с повышенной ионной силой, объединение фракций, содержащих биологическую активность ФРНТ, и лиофильную сушку, в котором, согласно изобретению, в качестве исходного сырья используют яд щитомордника, ионообменную хроматографию проводят перед гельфильтрацией и осуществляют ее в две стадии на колонке с носителем Соурс 15S, используя на первой стадии в качестве буферного раствора 0,14-0,16 М раствор уксуснокислого натрия с рН 6,3-6,5, а в качестве элюента - указанный раствор с концентрацией 0,27-0,29 М, полученный элюат разбавляют в 4-5 раз дистиллированной водой и повторно хроматографируют на колонке с тем же носителем, но в 13 раз меньшей по объему, используя в качестве буферного раствора 0,045-0,055 М раствор уксуснокислого натрия с рН 5,0-5,2, а в качестве элюента тот же раствор с концентрацией 0,95-1,05 М и рН 6,4-6,6 после чего проводят гельфильтрацию полученного элюата на Супердексе G-75 с 0,190,21 М раствором бикарбоната аммония при рН 6,4-6,6. Поставленная задача решается заявляемым способом, когда параметры процесса выделения ФРНТ находятся в пределах, указанных в формуле изобретения. При изменении параметров в сторону увеличения или уменьшения характеристики получаемого продукта ухудшаются. Проведение ионообменной хроматографии в 2 стадии перед гельфильтрацией на колонке с носителем Соурс 15S позволяет максимально очистить и сконцентрировать ФРНТ в минимальном объеме, что предполагает использование на ста дии гельфильтрации колонки с Супердексом G-75 меньшего размера, увеличение скорости элюции и, как следствие, сокращает время производственного цикла с 6 суток в прототипе до 23 часов в заявляемом способе. Физико-химическая стабильность носителей типа Соурс 15S и Супердекс G-75 гораздо выше, чем у целлюлозы КМ-52 и Сефадекса G-100, что позволяет проводить значительно большее количество производственных циклов без заметных изменений характеристик колонки. Использование в качестве исходного сырья яда щитомордника, рыночная стоимость которого почти в 15 раз ниже яда гюрзы, позволяет расширить сырьевую базу широкомасштабного пилотного производства ФРНТ. Изобретение иллюстрируется примерами 1-3 конкретного осуществления способа и таблицей сравнительных данных способа и прототипа. Пример 1. К 12,0 г яда щитомордника добавляют 200 мл 0,14 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,5, смесь перемешивают 30 минут при 4ºС. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4ºС в течение 15 минут. Осадок выбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют! равный объем раствора 0,14 М уксуснокислого натрия с рН 6,5, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0,14 М раствором уксуснокислого натрия (рН 6,5) колонку с Соурс 15S (размер колонки 5х4 см, объем - 80 мл). Через колонку пропускают 2,0 л 0,14 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,5. Скорость нанесения и элюции 30 см/час (10 мл/мин) Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-I (фирма "Pharmacia Biotech AR" (Швеция)). Основная часть белков (свыше 90 %) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 8,0, связывается с Соурс 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0,28 М уксуснокислого натрия с рН 6,5. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ собирают (116 мл), разбавляют в 5 раз дистиллированной водой, подводят рН до значения 5,0 и наносят на концентрирующую колонку с Соурс 15S (размер колонки 1,6х3 см, объем - 6 мл), уравновешенную 0,05 М раствором уксуснокислого натрия с рН 5,0, со скоростью 300 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech АВ" (Швеция). Через колонку пропускают 20 мл 0,05 М раствора уксуснокислого натрия с рН 5,0. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе и его элюируют ступенчатым градиентом 0,95 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,5. Весь белковый пик (6,4 мл) собирают и используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят на колонке с Супердексом G-75 (2,6х96 см), уравновешенной 0,2 М раствором бикарбоната аммония (рН 6,5). Колонку элюируют 0,2 М раствором бикарбоната аммония со скоростью 10 см/час (50 мл/час). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech АВ" (Швеция)). Белковый пик, содержащий 2 39983 биологическую активность собирают (22 мл) и высушивают лиофильно. Характеристика препарата: Выход, мг 22,80 мг (0,19% по белку) Выход по активности, % 98,0% Биологическая активность 6,0х10-8 г/мл Степень очистки, раз 526 Пример 2. К 11,9 г яда щитомордника добавляют 200 мл 0,15 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,4, смесь перемешивают 30 минут при 4ºС. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4ºС в течение 15 минут. Осадок выбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют равный объем раствора 0,15 М уксуснокислого натрия с рН 6,4, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0,15 М раствором уксуснокислого натрия (рН 6,4) колонку с Соурс 15S (размер колонки 5х4 см, объем - 80 мл). Через колонку пропускают 2,0 л 0,15 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,4. Скорость нанесения и элюции 30 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech AB" (Швеция)). Основная часть белков (свыше 90 %) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий изоэлектрическую точку выше 8,0, связывается с Соурс 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0,29 М уксуснокислого натрия с рН 6,4. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ, собирают (112 мл), разбавляют в 4,5 раза дистиллированной водой, подводят рН до значения 5,1 и наносят на концентрирующую колонку с Соурс 15S (размер колонки 1,6х3 см, объем - 6 мл), уравновешенную 0,055 М раствором уксуснокислого натрия с рН 5,1, со скоростью 300 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech AB" (Швеция)). Через колонку пропускают 20 мл 0,055 М раствора уксуснокислого натрия с рН 5,1. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе и его элюируют ступенчатым градиентом 1,05 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,6. Весь белковый пик (6,2 мл) собирают и используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят на колонке с Супердексом G-75 (2,6х96 см), уравновешенной 0,21 М раствором бикарбоната аммония (рН 6,6). Колонку элюируют 0,21 М раствором бикарбоната аммония со скоростью 10 см/час (50 мл/час). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech AB" (Швеция)). Белковый пик, содержащий биологическую активность собирают (21 мл) и высушивают лиофильно. Характеристика препарата: Выход, мг 22,40 мг (0,2% по бел ку) Выход по активности, % 97% Биологическая активность 5,0х10-8 г/мл Степень очистки, раз 535 Пример 3. К 12,1 г яда щитомордника добавляют 200 мл 0,16 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,3, смесь перемешивают 30 минут при 40С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 40С в течение 15 минут. Осадок выбрасывают, а к надосадочной жидкости добавляют равный объем раствора 0,16 М уксуснокислого натрия с рН 6,3, перемешивают и используют для ионообменной хроматографии. Раствор яда наносят на уравновешенную 0,16 М раствором уксуснокислого натрия (рН 6,3) колонку с Соурс 15S (размер колонки 5х4 см, объем - 80 мл). Через колонку пропускают 2,0 л 0,16 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,3. Скорость нанесения и элюции 30 см/час (10 мл/мин).Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech АВ" (Швеция)). Основная часть белков (свыше 90%) в данных условиях не адсорбируется на катионообменнике, а ФРНТ, имеющий зоэлектрическую точку выше 8,0, связывается с Соурс 15S и его элюируют ступенчатым градиентом ионной силы 0,27 М уксуснокислого натрия с рН 6,3. Белковый пик, содержащий активность ФРНТ собирают (121 мл), разбавляют в 4 раза дистиллированной водой, подводят рН до значения 5,0 и наносят на концентрирующую колонку с Соурс 15S (размер колонки 1,6х3 см, объем - 6 мл), уравновешенную 0,045 М раствором уксуснокислого натрия с рН 5,2, со скоростью 300 см/час (10 мл/мин). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech AB" (Швеция). Через колонку пропускают 20 мл 0,045 М раствора уксуснокислого натрия с рН 5,2. В выбранных условиях весь белок адсорбируется на носителе и его элюируют ступенчатым градиентом 1,0 М раствора уксуснокислого натрия с рН 6,4. Весь белковый пик (6,4 мл) собирают и используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят на колонке с Супердексом G-75 (2,6х96 см), уравновешенной 0,19 М раствором бикарбоната аммония (рН 6,4). Колонку элюируют 0,19 М раствором бикарбоната аммония со скоростью 10 см/час (50 мл/час). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора UV-1 (фирма "Pharmacia Biotech AB" (Швеция). Белковый пик, содержащий биологическую активность собирают (25 мл) и высушивают лиофильно. Характеристика препарата: Выход, мг 22,80 мг (0,19% по белку) Выход по активности 96,5% % Биологическая ак- 6,0х10-8 г/мл тивность Степень очистки, раз 531 3 39983 Таблица Сравнительные данные предлагаемого способа и прототипа Сравнительные параметры Время производственного цикла Количество перерабатываемого сырья в неделю Стоимость 1 г исходного сырья Стоимость сырья, перерабатываемого за неделю Выход продукта за 6-дневную рабочую неделю Выход по активности Биологическая активность Прототип » 6 суток Предлагаемый способ менее 24 часов 5г » 1200 $ 72 г 80 $ 6000 $ 5760 $ 78 мг 136 мг 98,1 % 5,3х10-8 г/мл 97,2 % 5,7х10-8 г/мл Как следует из результатов, представленных в таблице, за одну рабочую неделю (6 суток взято с учетом одного цикла выделения в прототипе) в прототипе и заявляемом способе расходуется сырья практически на одинаковую сумму, однако за счет большего количества производственных циклов выход конечного продукта в заявляемом способе практически в 2 раза больше. Это перекрывает дополнительные расходы на реактивы, стоимость которых относительно низкая. При этом характеристики ФРНТ в прототипе и заявляемом способе практически одинаковые, что делает процесс крупномасштабного пилотного производства более рентабельным и расширяет его сырьевую базу. _________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4