Спосіб одержання карбоксипептидази а

Спосіб одержання карбоксипептидази А, який полягає в тому, що тканину яєчників тварин, яка містить карбоксипептидазу А, гомогенізують, потім карбоксипептидазу А екстрагують охолодженим ацетоном, отриманий екстракт центрифугують, осад ресуспендують та екстрагують охолодженим ацетоном, потім отриманий екстракт центрифугують, надосадкові рідини об'єднують, висушують 3 містить прокарбоксипептидазу А активують на протязі 1 години в присутності трипсину у співвідношенні 100 мкг трипсину до 1 мл супернатанта), потім супернатант, який містить активовану карбоксипептидазу А хроматофокусірують на РВЕ94та єлюірують РВ74 буфером (Pharmacia). Фракцію, що отримають після хроматофокусіровання і яка містить карбоксипептидазу А додатково очищують на феніл-Сефарозе [Normant E., Gros С., Schwartz J. Carboxypeptidase A isoforms produced by distinct genes or alternative splicing in brain and other extrapancreatic tissues. - J. Biol. Chemistry. - 1995. - Vol. 270, № 35. - P. 20543 20549]. Недоліками відомого способу є додаткове використання комерційного препарату трипсину для активування прокарбоксипептидази А, що призводить до подорожчання карбоксипептидази А (1 г трипсину коштує 240,10 євро) та збільшує трудомісткість процесу. Відомий спосіб очистки карбоксипептидази А з підшлункової залози свині за допомогаю аніонообмінної хроматографії [Folk J.E., Schirmer Е. W. The porcine pancreatic carboxypeptidase A system. - J. Biol. Chemistry. - 1963. -Vol. 238, № 12. - P. 3884 - 3894]. Спосіб полягає в тому, що прокарбоксипептидазу А гомогенізують, потім екстрагують з тканини підшлункової залози охолодженим ацетоном у співвідношенні 1:5 (тканина/ацетон), потім екстракт фільтрують крізь паперовий фільтр. Отриманий таким чином осад ресуспендують з охолодженим ацетоном у співвідношенні 1:2 (тканина/ацетон), потім фільтрують, фільтрати об'єднують та висушують при кімнатній температурі. З ацетонового порошку на протязі 45 хв при 0-2 °С готують водний екстракт проферменту, який центрифугують 30 хв при 14,6 g, потім екстракт фракціонують сульфатом амонію при 0,35 М насиченні, потім центрифугують 30 хв при 14,6 g. Супернатант фракціонують сульфатом амонію при 0,6 М насиченні, потім центрифугують 30 хв при 14,6 g. Осад, отриманний при 0,6 М сульфатом амонію, обезсолюють на сефадексі G25 з 0,005 М Трис-HCL рН 8,0 в якості елюіруючого буферу, а потім 300-400 мл елюату фракціонують на DEAE-целюлозі з 0,005 М Трис-HCL рН 8,0 в якості елюіруючого буфера та елюірують лінейним градієнтом від 0 до 0,45 М NaCL у 0,005 М ТрисHCL буфері рН 8,0. Фракції, що містять прокарбокси-пептидазу А повторно фракціонують сульфатом амонію при 43% насиченні та діалізують проти дистильованої води. Фракцію ферменту піддають повторної хроматографії на DEAE-целюлозі у 0,005 М Трис-ацетатному буфері рН 6,0 та ілюструють лінейним градієнтом від 0 до 0,45 М NaCL у 0,005 М Трис- ацетатному буфері рН 6,0. Отриманий препарат прокар-боксипептидази А не втрачає ферментної активності на протязі 3 місяців під час зберігання при 0° С. Вихід ферменту становить 15 %. Даний спосіб обрано в якості прототипу. Недоліками способу є невисокий ступінь очистки (14,23 раз), процент виходу фермента (15 %) 40396 4 та многостадійність способу, що передбачає тривалість процесу (6 діб). В основу корисної моделі поставлена задача: створити спосіб одержання карбоксипептидази А з отриманням технічного ефекту, який полягає в збільшені виходу ферменту. Поставлена задача досягається тим, що тканину яєчників тварин, яка містить карбоксипептидазу А гомогенізують, потім карбоксипептидазу А екстрагують охолодженним ацетоном, отриманий екстракт центрифугують, осад ресуспендують та екстрагують охолодженним ацетоном, потім отриманний екстракт центрифугують, надосадкові рідини об'єднують, висушують при кімнатній температурі, потім з ацетонового порошку готують водний екстракт карбоксипептидази А, котрий додатково очищують від білкових та небілкових домішок, який відрізняється тим, що першу екстракцію охолодженним ацетоном проводять у співвідношенні 1:10 (тканина/ацетон) на протязі 60 хв при + 4 °С, осад отримують центрифугіруванням при 12 000 об/хв на протязі 45 хв, ресуспендування та екстракцію охолодженним ацетоном проводять у співвідношенні 1:5 (тканина/ацетон) на протязі 45 хв при + 4 "С, потім отриманний екстракт центрифугують 45 хв при 12 000 об/хв, а в якості екстрагуючого розчину ацетонового порошку використовують дистильовану воду. Загальними ознаками прототипу та способу, який пропонується, є те, що в обох способах карбоксипептидазу А екстрагують з тканини охолодженим ацетоном, осад ресуспендують, потім надосадкові рідини об'єднують, висушують при кімнатній температурі, отриману карбоксипептидазу А екстрагують з ацетонового порошку та додатково очищують від білкових та небілкових домішок. Відмінними ознаками способу, який пропонується, є те, що екстракцію карбоксипептидази А охолодженим ацетоном проводять у співвідношенні 1:10 (тканина/ацетон) на протязі 60 хв при + 4 °С, а не у співвідношенні 1:5, як у прототипі, екстракт центрифугують 45 хв при 12 000 об/хв, а не фільтрують крізь папір, як у прототипі, потім осад ресуспендують та екстрагують охолодженим ацетоном у співвідношенні 1:5 (тканина/ацетон), на протязі 45 хв при + 4 °С, а не у співвідношенні 1:2, як у прототипі, потім отриманний екстракт центрифугують 45 хв при 12 000 об/хв, отриману карбоксипептидазу А додатково очищують від білкових та небілкових домішок. Запропонований спосіб ілюструється наступним прикладом. Пропонуємий спосіб одержання карбоксипептидази А багаторазово випробувався в лабораторії біохімії ОНУ імені I.I. Мечникова з доброю відтворюванністю результатів. Помилка не перевищувала 5% при проведені понад 100 експериментів. Результати досліджень з найкращою відтворюванністю результатів наведені в таблицях 1 та 2. 5 40396 6 Таблиця 1 Вплив умов одержання карбоксипептидази А на питому активність та процент виходу ферменту (n=100) Співвідношення тканина/ ацетон Тривалість екстракції (хв) Тривалість центрифугірування (хв) Температура + °С Питома активність % виходу 1:8 45 45 2 52,07 ± 5,03 91,16% 1:10 60 60 4 57,12 ± 5,54 94,08 % 1:15 90 90 10 48,27 ± 4,73 79,50 % Питому активність карбоксипептидази А вимірювали в мМ фенілаланіну на мг білка за 1 хв інкубації при 37 °С. Нами визначено, що співвідношення 1:10 (тканина/ацетон) - є оптимальним, тому що за цей час досягається максимальний процент виходу ферменту (94,08 %) з максимальною питомою активністю (57,12). Зменшення або збільшення співвідношення тканина/ацетон недоцільно внаслідок зменшення питомої активності та втрати до 5 % ферменту. Встановлено, що оптимальною є екстракція на протязі 60 хвилин, тому що за цей час досягається максимальний процент виходу ферменту (94,08 %) з максимальною питомою активністю (57,12). Зменшення тривалості екстракції до 45 хвилин недоцільно тому, що при зводить до втрати 15,5 % ферменту. Збільшення тривалості екстракції до 90 хвилин практично не впливає на процент виходу ферменту та його питому активність, але є недоцільним тому, що збільшує тривалість процесу. Оптимальною температурою екстракції є + 4 °С, тому що за цей час досягається максимальний процент виходу ферменту з максимальною питомою активністю. Збільшення, або зменшення температури недоцільно тому, що призводить до втрати від 1,7 % до 12,5 % ферменту. В таблиці 2 наведені дані щодо впливу умов ресуспендування та повторної екстракції карбоксипептидази А на питому активність та процент виходу ферменту. Таблиця 2 Вплив умов ресуспендування та повторної екстракції на питому активність та процент виходу карбоксипептидази А (n=100) Співвідношення тканина/ ацетон 1:2 Тривалість ресуспен (хв) 15 Тривалість центрифугірування (хв) 30 Питома активність % виходу 3,06 ± 2,94 5,00 % 1:5 30 45 3,62 ± 3,46 5,92 % 1:10 45 60 3,60 ± 3,52 5,88 % Питому активність карбоксипептидази А вимірювали в мМ фенілаланіну на мг білка за 1 хв інкубації при 37°С. Нами встановлено, що процес ресуспендування та повторної екстракції є оптимальним на протязі 30 хвилин, тому що за цей час досягається максимальний процент виходу ферменту (5,92 %) з максимальною питомою активністю (3,62). Зменшення тривалості процесу до 15 хвилин недоцільно тому, що призводить до втрати 15,0 % ферменту. Збільшення тривалості екстракції до 45 хвилин практично не впливає на процент виходу ферменту та його питому активність, але є недоцільним тому, що збільшує тривалість процесу. Центрифугірування є оптимальним на протязі 45 хв, тому що за цей час досягається максимальний процент виходу ферменту з максимальною питомою активністю. Зменшення тривалості процесу центрифугірування до 30 хвилин недоцільно тому, що призводить до втрати 11,5 % ферменту. Збільшення тривалості центрифугірування до 60 хвилин практично не впливає на процент виходу ферменту та його питому активність, але є недоцільним тому, що збільшує тривалість процесу. Експериментальні дослідження запропонованого способу підтвердили, що поставлена задача успішно вирішується завдяки експериментальне встановленим оптимальним умовам процесу одержання карбоксипептидази А: співвідношенню наважки тканини та охолодженого ацетону, тривалості та умов процесу екстракції, умов процесу Центрифугірування, умов ресуспендування та повторної екстракції, тривалості процесу ресус 7 40396 пендування та повторної екстракції, умов центрифугірування повторного екстракту. Таким чином, запропонований спосіб у порівнянні з прототипом забезпечує отримання препарату ферменту з 94,5 % виходу при незнач Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 8 них матеріальних витратах, трудоємкості та малостадійності процесу. Спосіб, що пропонується, надається промисловим підприємствам для промислового використання. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601