Спосіб одержання церулоплазміну

Винахід відноситься до медицини, а саме до технології одержання білку плазми крові - церулоплазміну, і може бути використаний при виробництві ферментних лікарських препаратів з плазми крові. Церулоплазмін - мідьвмісний глобулярний білок плазми крові ссавців. Відомий спосіб одержання церулоплазміну, який полягає у гомогенізації осаду III фракції за Коном відходів виробництва гамма-глобуліну в розчині хлористого натрію, сорбції отриманого гомогенату на іонообміннику, елюції 0,25 М розчином хлористого натрію, виділенні ферменту з елюату, очищенні і стерилізуючій фільтрації [SU, авт. св., №1826193, кл. А61К38/48, опубл. 10.09.1995] [1]. Як іонообмінник використовують ДЕАЕ-целюлозу, активовану іонізуючим випромінюванням високих енергій безпосередньо після гомогенізації у розчині хлористого натрію. Виділення ферменту проводять шляхом додавання до елюату етилового спирту і хлороформу, суміш перемішують протягом 30 хвилин при 25°С і центрифугують. При очищенні до центрифугату додають при перемішуванні етиловий спирт, витримують при температурі мінус 10 °С протягом 18 годин і центрифугують. Недоліком відомого способу є зниження ферментивної активності цільового продукту у процесі виробництва та низький вихід цільового продукту. Так, біологічна активність цільового продукту - 17 ум. одиниць, оптичний коефіцієнт - 0,04-0,042, вихід - 1,35-1,5г з 1кг сировини. Відомий спосіб одержання церулоплазміну включає гомогенізацію відходів виробництва імуноглобулінів або альбумінів у розчині хлористого натрію, сорбцію на іонообміннику розчином хлористого натрію при рН 5,0...5,2, елюцію 0,24...0,26 М розчином хлористого натрію при рН 5,5, очищення етиловим спиртом і сумішшю спиртхлороформу, стерилізуючу фільтрацію та ліофілізацію [UA, патент № 61200 А, кл. А61К35/16, опубл. 15.11.2003] [2]. Недоліками відомого способу є знижена біологічна активність церулоплазміну (16-18 одиниць) та невисокий вихід цільового продукту. Найбільш близьким є спосіб одержання церулоплазміну, який включає розчинення відходів виробництва імуноглобулінів або альбуміну в буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику, елюцію, виділення ферменту з елюату, очи щення і ультрафільтрацію [RU, патент № 2087150, кл. А61К35/16, опубл. 20.08.1997] [3]. Процеси сорбції, елюції, виділення ферменту, очищення та ультрафільтрацію проводять при температурі 2 ... 5°С. Сорбцію на іонообміннику, де як такий використовують ДЕАЕ-се фадекс А-50, проводять протягом 5...7 годин. Виділення ферменту з елюату проводять шляхом відстоювання елюату з концентрацією білка 0,5...20% протягом 6...12 годин при рН 5,1...5,4 і іонній силі 0,01...0,04 з наступним центрифугуванням і концентруванням, яке здійснюють ультрафільтрацією. Недоліком відомого способу є низький вихід цільового продукту, який становить 70...80%. Задачею винаходу є підвищення виходу цільового продукту при забезпеченні високої чистоти і активності церулоплазміну. Поставлена задача досягається тим, що у запропонованому способі одержання церулоплазміну, що включає розчинення відходів виробництва імуноглобулінів або альбуміну в буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику, елюцію, виділення ферменту з елюату шляхом осадження та центрифугування, і ультрафільтрацію, сорбцію проводять протягом 12... 18 годин, осадження при виділенні ферменту з елюату проводять послідовним додаванням етилового спирту і хлороформу, одержану суміш нагрівають до 16...25 °С, витримують протягом 2,5...3,5 годин з наступним центрифугуванням і очищенням центрифугату. У запропонованому способі як іонообмінник використовують ДЕАЕ-сефадекс А-50, як відходи виробництва імуноглобулінів використовують осад Б, як відходи виробництва альбумінів використовують фракцію IV-1 СПК. Елюцію проводять на нутч-фільтрі з використанням буферного розчину для промивання, а очищення центрифуга ту проводять при рН 5...6 шляхом додавання до центрифугату етилового спирту з температурою 18...22°С, причому, суміш перемішують протягом 55...65 хвилин, витримують протягом 2,5...3,5 годин і центрифугують. Експериментальне нами були підібрані умови, що сприяють збереженню церулоплазміну, відділенню високомолекулярних домішок та отриманню активного і чистого продукту. Вихід очи щеного сирого церулоплазміну становить 6,4...6,5г з одного кг сировини, що становить 95...98%, біологічна активність - 30...35 одиниць, оптичний коефіцієнт - 0,67. Спосіб здійснюється таким чином. Відхід фракціонування імуноглобулінів - осад Б, або альбуміну - 4-1 СПК змішують з буферним розчином при температурі розчину 0...2°С, перемішують протягом 3...5 годин і центрифугують. Осад знешкоджують і утилізують. Сорбцію ферменту здійснюють за допомогою іонообмінника, для чого до надосадної рідини додають іонообмінник - ДЕАЕ-сефадекс А-50 і витримують протягом 12...18 годин при температурі 2°С. По закінченню проводять елюцію на нутч-фільтрі з використанням буферного розчину для промивання. Виділення ферменту з елюату проводять осадженням з наступним центрифугуванням. Для осадження до елюату послідовно додають етиловий спирт (96°), потім хлороформ, суміш нагрівають до температури 16...25°С, витримують протягом 2,5...3,5 годин. Одержаний центрифугат очи щують шля хом додавання до нього етилового спирту з температурою 18...22°С, перемішування суміші протягом 55...65 хвилин, витримування протягом 2,5...3,5 годин і центифугування. Одержаний осад розчиняють і ультрафільтрують. З ультрафільтрату отримують готову лікарську форму. Приклад 1 1 кг осаду Б змішують з 15 л фосфатного буферного розчину, рН 5,9, при температурі розчину 0°С, перемішують протягом 4,5 годин і центрифугують. Осад знешкоджують і утилізують. До надосадної рідини додають 4,5г попередньо підготовленого ДЕАЕ-сефадекс А-50 і витримують протягом 12 годин при температурі 2°С. Елюцію проводять на нутч-фільтрі, промивають 5,4л фосфатного буферного розчину. До елюату послідовно додають 0,55мл етилового спирту (96°), потім - 0,65мл хлороформу. Суміш нагрівають до температури 18°С, витримують протягом 2,5 годин. До одержаного центрифугату додають 0,45мл етилового спирту з температурою 20°С, перемішують суміш протягом 55 хвилин, витримують протягом 3 годин і центифугують. Осад розчиняють і ультрафільтрують. Отримують 6,4г сирого осаду, готового до приготування лікарської форми. Вихід - 95%, біологічна активність 35 одиниць, оптичний коефіцієнт - 0,67. Приклад 2 1 кг фракції IV-1 СПК змішують з 15л фосфатного буферного розчину, рН 6, при температурі розчину 2°С, перемішують протягом 4,5 годин і центрифугують. Осад знешкоджують і утилізують. До надосадної рідини додають 5,1г попередньо підготовленого ДЕАЕ-сефадекс А-50 і витримують протягом 15 годин при температурі 2 °С. Елюцію проводять на нутч-фільтрі, промивають 6л фосфатного буферного розчину. До елюату послідовно додають 0,55мл етилового спирту (96°), потім - 0,45мл хлороформу. Суміш нагрівають до температури 18°С, витримують протягом 2,5 годин. До одержаного центрифугату додають 0,5мл етилового спирту з температурою 20°С, перемішують суміш протягом 60 хвилин, витримують протягом 3 годин і центифугують. Осад розчиняють і ультрафільтрують. Отримують 6,5г сирого осаду, готового до приготування лікарської форми. Вихід становить 98%, біологічна активність 30 одиниць, оптичний коефіцієнт - 0,67. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє отримувати з високим виходом церулоплазмін високої чистоти і активності.