Спосіб визначення стану активності лужної фосфатази нейтрофілів

Спосіб оцінки стану активності лужної фосфатази нейтрофілів, що включає реєстрацію дати дослідження, забір капілярної крові, приготування мазка, висушування мазка, фіксацію мазка у розчині формаліну в абсолютному етанолі, інкубацію aмазка із забуференим розчином нафтилфосфату (рН 9,75) з фарбником міцним гранатовим, промивання проточною водою, дофарбовування мазка метиловим зеленим, висушування на повітрі, визначення у 100 нейтрофілах 3 - фіксація мазка в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С; - інкубація мазка при кімнатній температурі протягом 5-10хв. у свіжоприготованому субстратно-буферному розчині (рН 9,75), який містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a нафтілфосфату натрію, 35мг міцного гранатового; - швидке промивання проточною водою; - дофарбовування 2% метиловим зеленим протягом 15±1хв.; - висушування; - мікроскопування; - виявлення активності ЛФн за забарвленою у коричневий колір цитоплазмою нейтрофілів; - підрахунок активності ЛФн у 100 нейтрофілах в умовних одиницях за Астальді-Верга; - порівняння отриманих даних з даними контролю і висновок за цим показником про стан активності лужної фосфатази в пацієнта. Відомий спосіб оцінки стану активності ЛФн за параметрами її річного біоритму [Н.В. Колесник, Н.Г. Баранник, Ю.А. Кривохацкая, Г.Б Стерн, Н.Б. Широколобова. Параметры годовых ритмов активности ферментов лейкоцитов практически здоровых лиц // Тезисы докладов научно-практической конференции врачей г. Запорожье, посвященной памяти выдающихся медиков - рационализаторов В.В. Ярошенко и Я.Р. Гасуля. Запорожье. - 1994. 156 с. - С.95-97], який включає: - реєстрацію місяця і години забору капілярної крові; - забір капілярної крові; - приготування мазка; - висушування мазка на повітрі; - фіксацію мазка в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5 °С; - інкубацію мазка при кімнатній температурі протягом 5-10хв. у свіжоприготованому субстратно-буферному розчині (рН 9,75), який містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a нафтілфосфату натрію, 35мг міцного гранатового; - швидке промивання проточною водою; - дофарбовування метиловим зеленим протягом 15±1хв.; - висушування; - мікроскопування; - виявлення активності ЛФн за забарвленою у коричневий колір цитоплазмою нейтрофілів; - підрахунок активності ферменту у 100 нейтрофілах залежно від ступеня забарвлення цитоплазми в умовних одиницях; - порівняння даних із середньорічним значенням цього показника в популяції, який беруть за норму, а амплітуду річного коливання - за верхню і нижню межі норми, і висновок за цим показником про стан активності лужної фосфатази. Недоліком даного способу є неможливість порівняння активності ЛФн досліджуваного зразка крові з такою, яка відповідає сезону дослідження, що обумовлює некоректну оцінку результатів дослідження. Спільними з прототипом ознаками є: - реєстрація дати забору капілярної крові; 42062 4 - забір капілярної крові; - приготування мазка; - висушування мазка на повітрі; - фіксація мазка в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С; - інкубація мазка при кімнатній температурі протягом 5-10хв. у свіжоприготованому субстратно-буферному розчині (рН 9,75), який містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a нафтілфосфату натрію, 35мг, барвника міцного гранатового; - швидке промивання проточною водою; - дофарбовування 2% метиловим зеленим протягом 15±1хв.; - висушування; - мікроскопування; - виявлення активності ЛФн за забарвленою у коричневий колір цитоплазмою нейтрофілів; - підрахунок активності ЛФн у 100 нейтрофілах в умовних одиницях за Астальді-Верга; В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення стану активності лужної фосфатази нейтрофілів (ЛФн), який шляхом цитохімічної реакції і врахування залежності активності ферменту від сезону року, дозволяє здійснити експрес-оцінку стану активності ЛФн в обстежуваної особи, підвищити її точність і коректність. Суттєвими ознаками способу є: - реєстрація дати забору капілярної крові; - забір капілярної крові; - приготування мазка; - висушування мазка на повітрі; - фіксація мазка в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С; - інкубація мазка у свіжоприготованому субстратно-буферному розчині (рН 9,75), який містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a -нафтілфосфату натрію, 35мг міцного гранатового при кімнатній температурі протягом 5-10хв.; - швидке промивання проточною водою; - дофарбовування 2% метиловим зеленим протягом 15±1хв.; - висушування; - мікроскопування; - виявлення активності ЛФн за забарвленою у коричневий колір цитоплазмою нейтрофілів; - підрахунок активності ЛФн у 100 нейтрофілах в умовних одиницях за Астальді-Верга; - розрахунок відносної активності ЛФнвідн. у досліджуваної особи за формулою: ЛФнп ´ 100% , (1) ЛФнвідн. = 36,3 + 15x , де - ЛФнвідн. - відносна активність ЛФн у обстежуваної особи, %; - ЛФнп - активність ЛФн в обстежуваної особи, у.о.; - 36,3 - постійний коефіцієнт активності ферменту в популяції протягом року, у.о.; - 1,5 - постійний коефіцієнт впливу місяця року на активність ЛФн; 5 - х - порядковий номер місяця року; - визначення за цим показником стану активності лужної фосфатази у пацієнта. Відмінними від прототипу ознаками є визначення відносної активності лужної фосфатази нейтрофілів за формулою 1 шляхом порівняння результатів активності ЛФн пацієнта зі значеннями активності ферменту в популяції у конкретний місяць року. Спосіб обґрунтовано щомісячними дослідженнями протягом трьох років (394 особи) активності ферменту в мазках периферичної крові позаштатних донорів з діагнозом «здоровий» і відсутністю змін у лейкоцитарній формулі. Досліджували кров, що була відібрана між 9-10 годинами ранку; готували мазки; висушували їх на повітрі; фіксували в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С; наносили на мазки 3-5мл свіжоприготованого інкубаційного середовища, яке містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a -нафтілфосфату натрію, 35мг міцного гранатового при кімнатній температурі протягом 5-10хв.; швидко промивали проточною водою; дофарбовували 2% метиловим зеленим протягом 15±1хв.; висушували; мікроскопували; активність ЛФн виявляли за забарвленою у коричневий колір цитоплазмою у 100 нейтрофілах, яку виражали в умовних одиницях, залежно від ступеня забарвлення цитоплазми, для чого досліджувані нейтрофіли розподіляли на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++), число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножували на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складає умовні одиниці (у.о.). Статистичний аналіз отриманої бази даних здійснювали за допомогою ППП SPSS, модулів «Регресія» - метод зважених найменших квадратів, «Факторний аналіз», «Часові ряди» і «Графічний аналіз». Активність ферменту в практично здорових осіб не залежить від віку і статі. На основі статистичного аналізу бази даних було встановлено залежність активності лужної фосфатази від сезону року, що відображується рівнянням ЛФнм = 36,3 + 1,5х , (2) де: ЛФнм - активність лужної фосфатази нейтрофілів, що відповідає конкретному місяцю року, у.о.; 36,3 - постійний коефіцієнт значення активності ЛФн у популяції протягом року, у.о. 1,5 - постійний коефіцієнт місяця року; X - порядковий номер місяця року. 95% довірчий інтервал дорівнює ±5 у.о. Спосіб здійснюють таким чином: реєструють дату дослідження, проводять забір капілярної крові; готують мазки; висушують їх на повітрі; фіксують у 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С; наносять на мазки 3-5мл свіжоприготованого інкубаційного середовища (рН 9,75), яке містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a нафтілфосфату натрію, 35мг міцного гранатового при кімнатній температурі на 5-10хв.; швидко про 42062 6 мивають проточною водою; дофарбовують 2% метиловим зеленим протягом 15±1хв.; висушують; мікроскопують; активність ЛФн виявляють за забарвленою у коричневий колір цитоплазмою у 100 нейтрофілах, яку виражають в умовних одиницях залежно від ступеня забарвлення цитоплазми, для чого досліджувані нейтрофіли розподіляють на 4 групи: з негативною реакцією (-), слабкопозитивною (+), позитивною (++) і різко позитивною (+++), число нейтрофілів з однаковою інтенсивністю забарвлення помножують на відповідне даній групі число плюсів, сума цих добутків складає умовні одиниці (у.о.).; визначають відносну активність ЛФнвідн. за формулою 1, і за цим показником роблять висновок про стан активності лужної фосфатази нейтрофілів пацієнта і при значенні показника у діапазоні 100±15 діагностують норму. Приклад конкретного виконання. Пацієнтка К., вік - 29 років. Діагноз - вагітність 31 тиждень, загроза переривання вагітності. Дата дослідження активності ЛФн - 19 лютого 2008р. Здійснювали забір капілярної крові; готували мазок; висушували його на повітрі; фіксували в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С; наносили на мазок 3-5мл свіжоприготованого інкубаційного середовища (рН 9,75), яке містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a нафтілфосфату натрію, 35мг міцного гранатового при кімнатній температурі на 5-10хв.; швидко промивали проточною водою; дофарбовували 2% метиловим зеленим протягом 15±1хв.; висушували; мікроскопували; визначали активність ферменту за забарвленою у коричневий колір цитоплазмою нейтрофілів; у 100 нейтрофілах підраховували активність ЛФн в умовних одиницях за Астальді-Верга. Активність ферменту вагітної жінки складала 76 у.о. Розраховували відносну активність ЛФнвідн. у пацієнтки за формулою 1: 76 ЛФнвідн. = ´ 100% = 193,4% . 36,3 + 1,5 ´ 2 Значення активності лужної фосфатази нейтрофілів у пацієнтки перевищує показник популяції у лютому в два рази, що характеризує участь цієї групи ферментів (лужних фосфатаз) у патогенезі невиношування вагітності. Пацієнт Т., вік - 23 роки. Діагноз - загострення лівобічного хронічного мезотімпаніту. Дата дослідження активності ЛФн - 12 грудня 2007р. Здійснювали забір капілярної крові; готували мазок; висушували його на повітрі; фіксували в 10% розчині формаліну в абсолютному етанолі протягом 30±1с при температурі 0±5°С; наносили на мазок 3-5мл свіжоприготовленого інкубаційного середовища (рН 9,75), яке містить у 35мл 0,05моль/л пропандіолового буферу 35мг a нафтілфосфату натрію, 35мг міцного гранатового при кімнатній температурі на 5-10хв.; швидко промивали проточною водою; дофарбовували 2% 7 42062 метиловим зеленим протягом 15±1хв.; висушували; мікроскопували; визначали активність ферменту за забарвленими у коричневий колір гранулами; у 100 нейтрофілах підраховували активність ЛФн в умовних одиницях за Астальді-Верга. Активність ЛФн хворого складала 80 у.о. Розраховували відносну активність ЛФнвідн. у пацієнта за формулою: 80 ЛФнвідн. = ´ 100% = 147,3% 36,3 + 1,5 ´ 2 Відповідно до отриманих даних активність ЛФн пацієнта Т. при загостренні хронічного мезотімпаніту підвищена практично на 50 %, що в умовах Комп’ютерна верстка А. Крулевський 8 хронічного деструктивного процесу у вусі хворого слід розглядати як показник тяжкості запалювального процесу, який супроводжується порушенням кислотно-лужного балансу. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє проводити експрес-оцінку стану метаболічної активності клітин запалення обстежуваного з урахуванням стану активності лужної фосфатази в популяції, яка відповідає місяцю дослідження, що забезпечує коректне оцінювання результатів аналізу пацієнта та обумовлює призначення адекватної терапії. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601