Спосіб гістохімічної діагностики ракових захворювань

Спосіб гістохімічної діагностики ракових захворювань шляхом дослідження продуктів гістохімічної реакції на мазку крові в зоні дії діагностичних реагентів, який відрізняється тим, що на 3 як реакція проходить тільки при визначених відповідних параметрах; - недостатня специфічність та чутливість даного способу (не відповідають на практиці рівню вказаних у патенті відповідних показників). В основу корисної моделі, що заявляється, поставлене завдання створення інформативного способу гістохімічної діагностики ракових захворювань по мазках крові, придатного для простого виконання, та який мав би високу ліквідність (спроможність поширення способу в медичних закладах через придбання ними ліцензій на патент). Вирішення цього завдання досягнуте за рахунок застосування нових реагентівдіагностикумів, таких, як іншого комплексоноутворювача оксіетилендифосфонової кислоти (ОЕДФ), стандартного біологічно активного донатора лужноземельного металу кальцію - кальцієвого комплексу альдонової та етилендіаміндибурштинової кислоти (СаЕДДБ) та нового проявника продуктів гістохімічної реакції (агрегованих аномальних внутрішньоядерних білків ракових клітин) насиченого розчину реактиву Шифа. Передумовою створення способу стала запропонована у 1996 р. Є.І.Сусловим та Т.П. Підгаєвською концепція про виключну роль ядерних кальцій - зв'язуючих білків у регуляції стабільності геному. Згідно вищесказаного, канцерогенез супроводжується виходом кальцію та фракцій внутрішньоядерних кальцій - зв'язуючих білків із хроматину клітин-мішеней у сироватку крові [див. Суслов Е.И. и др. / Роль ДНК - протеин- Са2+комплексов в канцерогенезе. Методы их определения для ранней диагностики злокачественных опухолей легких // Журн. АМН Украины. - 1997.- № 3.- С. 282 – 290]. Враховуючи цей факт, авторами запропонована гістохімічна методика визначення вказаних фракцій ядерних кальцій - зв'язуючих білків, титр яких може свідчити про активність (силу) злоякісної пухлини в організмі людини. За способом, що заявляється, гістохімічна реакція на рак по мазках крові полягає у взаємодії біологічного матеріалу з розчином комплексоноутворювача, донатором кальцію -кальцієвого комплексу альдонової та етилендіаміндибурштинової кислоти та проявника реакції - реактива Шифа. У дослідах на мазках крові 90 випадках хворих на рак та 50 контрольних тестах здорових людей була відпрацьована методика проведення вказаної гістохімічної реакції. На сухі мазки периферийної крові пацієнтів послідовно, з інтервалом 10хв. наносять по 1 краплині розчинів комплексоноутворювача оксіетилендифосфонової кислоти (ОЕДФ), біологічно активного донатора лужноземельного металу кальцію - кальцієвого комплексу альдонової та етилендіаміндибурштинової кислоти (СаЕДДБ) та індикатора реакції -реактива Шифу. Встановлено, що концентрація водного розчину ОЕДФ оптимально повинна знаходитися у межах 6,0ваг.% - 10,0ваг. %. При його концентрації менше, ніж 6% настає псевдонегативний результат, а підвищення його концентрації більш, ніж 10% призводить до псевдопозитивного результату. Концентрація розчину СаЕДДБ оптимально повинна знаходитися у межах 1,0ваг. % - 3,0ваг. %. 43904 4 Його концентрації менше, ніж 1,0ваг. % призводить до псевдонегативного результату, а підвищення концентрації більш, ніж 3,0ваг. % призводить до псевдопозитивного результату. Експериментальним шляхом встановлено, що для отримання достовірних результатів дослідження рН розчинів діагностикумів бажано повинна дорівнювати 7,3-7,4, як і фізіологічне рН крові здорових людей. Діагностичну оцінку результатів проводять методом мікроскопії осаду на склі після висихання діагностикумів на мазку крові в зоні реакції. При виявленні чітких аморфних преципітатів в центрі зони гістохімічної реакції у хворих на рак людей у вигляді конденсованих пластівців, що містять фракції внутрішньоядерних кальцій - зв'язуючих білків ракових клітин, проти виявлення чітких радіальних промінів на контрольних мазках (здорових людей) діагностують злоякісну пухлину. Спосіб гістохімічної діагностики ракових захворювань, що патентується, дозволяє ідентифікувати аномальні внутрішньоядерні кальцій - зв'язуючі білки ракових клітин на мазках периферійної крові пацієнтів, що є достовірними, чутливими та інформативними ознаками прогресуючої злоякісної пухлини в організмі людини. Перевагами даного способу діагностики раку над способом - прототипом є наступне: - спрощення виконання методу за рахунок усунення етапу засвічування мазків крові за методом прототипу, а також здешевлення витрат на реактиви за рахунок заміни проявника реакції азотнокислого срібла (дорогоцінного металу) на простий, дешевий реактив Шифа; - усунення одного з діагностикумів прототипу нестандартного білкового реактиву - багатокомпонентної сироватки крові донорів з невизначеною молекулярною масою, що унеможливлювало ліквідність методу, шляхом заміни його на кальцієвий комплекс альдонової та етилендіаміндибурштинової кислоти з визначеною молекулярною масою, що надало спроможності розробленому способу онкологічної діагностики бути ліквідним (втіленим у мережу медичних закладів) нескладним методом гістохімічної діагностики на рак. Корисна модель може бути проілюстрована наступними прикладами. Приклад 1. Пацієнт Ш-ко звернувся зі скаргами на болі у грудях, кашель, схуднення на 5кг, слабкість. На мазку крові з пальця була проведена гістохімічна реакція методом, що патентується. Спочатку на мазок крові була нанесена краплина 6,0ваг.% розчину комплексоноутворювача - оксіетилендифосфонової кислоти (ОЕДФ), далі краплина 2,0ваг.% біологічно активного донатора лужноземельного металу кальцію - кальцієвого комплексу альдонової та діамінодибурштинової кислоти (СаЕДДБ) краплина насиченого розчину реактиву Шифа. При висиханні мазків крові була проведена аналітична оцінка результатів гістохімічної реакції на рак. В центрі зони реакції чітко виявлялися пластівці аномальних внутрішньоядерних білків ракових клітин пурпурно-синього кольору, що свідчило про позитивну реакцію. При рентгенологічному обстеженні органів грудної порожнини у хворого в лівій легені була виявлена 5 43904 пляма з нерівними контурами, що підтвердило підозру на рак. Інші дані клінічного та гістологічного обстеження також співпали, чим було підтверджено ракове захворювання у пацієнта та доведена інформативність способу, що заявляється. На паралельному мазку крові цього пацієнта була поставлена реакція за методом - прототипом з нестандартним реактивом - сироваткою донорської крові. В результаті гістохімічної реакції в центрі зони дії реагентів отримана пляма чорнокоричневого кольору з нечіткою структурою кінцевих продуктів реакції, що не давало можливість однозначно встановити наявність, або відсутність онкологічного процесу. Приклад 2. Пацієнтка М-ко звернулася для профілактичного обстеження на рак. Скарг не було, відмічалася незначна стурбованість захворіти на рак, тому що від раку померла її мати. В ході огляду хворої було встановлено невелике ущільнення в тканинах правої молочної залози в місці перенесеного маститу. При постановці двох варіантів методики гістохімічної реакції на рак, що заявляється, з реактивами у концентрації нижчої (ОЕДФ - 2ваг.%, СаЕДДБ - 0,1ваг.%) та у концентрації вищої, ніж вказані у даній заявці на корисну модель (ОЕДФ 1, ваг.%, СаЕДДБ - 5,0 ваг.%), результати були недостовірні, хибні - псевдонегативні та псевдопозитивні. При постановці даної реакції з реактивами в межах концентрацій реагентів, що вказані у заявці (ОЕДФ -5,0 ваг.%, СаЕДДБ - 2,0 ваг.%), результат був від'ємний, що відповідало даним клінічного обстеження пацієнтки і діагнозу мастопатії. Приклад 3. Пацієнт Ш-ли звернувся зі скаргами на збільшення лімфатичних вузлів. При дослідженні результатів пункційної біопсії лімфатичного вузла цитологічним методом встановили діагноз 6 лімфогранулематозу. Хворому був запропонований курс опромінення та хіміотерапії. Хворий вирішив перевірити встановлений діагноз онкотестуванням за мазком крові. При постановці гістохімічної реакції на рак способом, що заявляється у даній заявці на корисну модель з реактивами в межах вказаної концентрації: - ОЕДФ - 10,0 ваг.%, СаЕДДБ - 1,0 ваг.% у двох варіантах. В одному варіанті був застосований проявник продуктів реакції за методом прототипу - розчин азотнокислого срібла, в другому випадку проявник, що заявляється реактив Шифу. При аналітичній оцінці результатів була визначена значна різниця у кольоровій гамі продуктів реакції (забарвлення пластівців аномальних внутрішньоядерних білків ракових клітин). У першому варіанті, виконаним з проявником реакції за методом прототипу - з азотнокислим сріблом, не чітко визначалися продукти реакції, все було імпрегновано сріблом і забарвлено в коричневий колір. У другому варіанті - з проявником реакції - реактивом Шифу в зоні дії реагентів визначався чіткий зернястий матеріал продуктів реакції пурпурно-синього кольору, що було визначено позитивним результатом та вдалим удосконаленням на користь інформативності даного гістохімічного способу. У подальшому, при дослідженні гістологічних препаратів біопсії лімфатичного вузла хворому був встановлений діагноз лімфогранульоматозу. Таким чином, був підтверджений позитивний результат попередньої гістохімічної реакції на ракове захворювання. Запропонований спосіб був застосований для діагностики раку у 90 пацієнтів -хворих на злоякісні пухлини та у 50 здорових осіб. Результати оцінки діагностичної чутливості і діагностичної специфічності способу, що заявляється, проводились згідно рекомендації Американського Протиракового Товариства (див. табл. 1 і табл. 2). Таблиця 1 Результати обстеження хворих на злоякісні пухлини запропонованим способом Локалізація пухлини Молочна залоза Рак легень Рак прямої кишки Рак нирок Рак матки Рак яєчників Всього Кількість об- Кількість істинопозити- Кількість псевдопозитив- Діагностична чутлистежених вних результатів (абс.) них результатів (абс.) вість (%) 16 14 2 87,6 10 9 1 90,0 10 10 100 6 100,0 6 100,0 1 100,0 50 Таблиця 2 Результати обстеження здорових осіб запропонованим способом Кількість обстежених 50 Кількість істинонегативних результатів (абс.) 48 Таким чином, у порівнянні із прототипом розроблений спосіб гістохімічної діагностики на рак дозволяє: Кількість псевдопозитивних результатів (абс.) 2 Діагностична специфічність (%) 96 - підвищити точність дослідження за рахунок застосування стандартного біологічно активного донатора лужноземельного металу кальцію кальцієвого комплексу альдонової та етилендіамі 7 43904 ндибурштинової кислоти (СаЕДДБ) з відомою молекулярною масою, що надало спроможності цьому методу бути ліквідним способом онкотестування: - підвищити діагностичну чутливість від 87,6% до 100%, - підвищити специфічність способу до 96%; - усунути один з нестандартних діагностикумів прототипу - донатора кальцію - багатокомпонентну Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 8 сироватку крові донорів, що унеможливлювало ліквідність методу. Спосіб гістохімічної діагностики ракових захворювань, що заявляється, простий, універсальний, придатний для скринінгової діагностики різноманітних злоякісних пухлин, не потребує великих затрат на виконання. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601