Спосіб очищення сироватки крові великої рогатої худоби

Спосіб очищення сироватки крові великої' рогатої худоби (ВРХ), що включає очищення розчином пол (етиленгліколю від у-глобуліново'і фракції білків нативної сироватки крові ВРХ, який відрізняється тим, що додатково триразово заморожують (-20°С) і збирають надосадову рідину Корисна модель (KM) відноситься до ветеринарної' вірусології та біотехнології і може бути використаний для вирощування клітинних культур та накопичення на їх основі біомаси вірусів. Сироватка крові - обов'язковий компонент ростових живильних середовищ для культивування клітинних культур До її складу входить ряд біологічно активних речовин, необхідних для росту клітин in vitro. Поряд з біологічно активними речовинами сироватка крові ВРХ містить різні фракції імуноглобулінів. Гамма-глобуліни є специфічними до збудників інфекцій, тому при індикації або накопиченні вірусів з використанням культур клітин, їх наявність знижує інфекційний титр вірусів, а іноді взагалі перешкоджає їх реплікації в клітинах Наприклад, при накопиченні ротавірусів великої рогатої худоби в культурі клітин нирки теляти з використанням сироватки крові великої рогатої' худоби, яка вміщувала специфічні до ротавірусів глобуліни, інфекційний титр вірусу знижувався на 2-3 Ід ТЦД 50/см3 (Букринская Ротавирусная инфекция / М Наука, 1990. -213с). Вилучення у-глобулінів із сироватки крові ВРХ дозволяє використовувати ії без попередньо перевірки на наявність специфічних глобулінів для культивування клітинних культур з метою накопичення вірусів В Україні сироватка ВРХ виготовляється виробниками без очищення від у-глобуліново"і фракції білків та перевірки на наявність специфічних антитіл. Прототипом способу очистки, що патентується, є "Способ очистки сыроватки крови крупного рогатого скота. Л.И. Игудин, С Д Орлов, Н В. Ша лунова и др. // Вопр. вирусологии. - 1980 №5. С.640". Для очистки від у-глобулінової фракції' білкгв сироватку крові ВРХ обробляли стерильним 40% розчином поліетиленгликолю (ПЕГ) з мол м. 5500-7000 (фірма "Serva", ФРГ), кінцева концентрація якого у сироватки доводили до 6-8% Після експозиції 16-18 годин при +4°С сироватку центрифугували при 2000-3000об./хв. протягом 20 хвилин для видалення ПЕГ. Вміст білку в сироватці після обробки ПЕҐом знижувався в 2 рази. Основним недоліком цього способу очистки є залишкова дуже висока концентрація ПЕГу в сироватки крові, що негативно впливає на ріст клітин і робить фактично неможливим тривале їх культивування В основу KM, що передбачається, поставлено задачу розробити спосіб очищення сироватки крові ВРХ, що включає очищення розчином ПЕГ від углобулінової фракції' білків нативної сироватки крові ВРХ шляхом подальшого триразового заморожування (-20°С) і збирання надосадової рідини, щоб забезпечити спосіб очищення сироватки крові ВРХ. Більш повне видалення глобулінової фракції' білків сироватки крові та залишків ПЕГ можливе завдяки використанню цього способу. При очищенні комерційної нативної сироватки крові ВРХ спосіб виконується таким чином, до стерильної сироватки крові ВРХ вносять 50%-й стерильний пол і етиленгліколь (ПЕГ-6000) фірми Merck у співвідношенні 9 1 {дев'ять частин сироватки та одна частина ПЕГа) та перемішують впродовж 20 хвилин не допускаючи спінювання сироватки, залишають на 12 годин при температурі 45°С. Надосадову рідину відбирають та заморожують при -20°С. Заморожування та вщтаювання з відбором надосадової рідини повторюють тричі. CM со 4432 Остаточна концентрація ПЕГу в сироватці крові ВРХ (визначена у відповідності з ТУ 10-19-59-89) знаходиться на рівні 1,0-2,5%. На виході з однієї частини нативної сироватки крові ВРХ, що піддається обробці ПЕГ, отримується 0,83 частини сироватки з пониженою фракцією високомопекупярних білків, котру використовують для вирощування перещеплюваних та первинних клітин тварин Приклад 1. При вивченні ростових властивостей очищеної запропонованим способом сироватки крові ВРХ у порівнянні з нативною сироваткою крові ВРХ та з сироваткою, очищеною за протоколом Л.І. Ігудіна та ін., їх вносили в живильне середовище для росту перещеплюваних клітин FLK-71, ВНК-21 та РК15 в кількості 10% Строк формування моношару клітин, вирощуваних на середовищі, що вміщує сироватку крові, очищеною за запропонованим способом, впродовж всіх пасажів перевищував аналогічний показник в інших двох середовищах Моношар культур не відрізнявся за морфологією клітин, вирощених у середовищах, що вміщували сироватку крові, як очищену за KM, що передбачається, так і нативну сироватку крові. Клітини, вирощені на середовищі з сироваткою крові, обробленої за способом прототипу, мали округлу Комп'ютерна верстка А Рябко форму, а в моношарі спостерігались гігантські клітини На 3-му пасажі цих клітин у моношарі спостерігались чітко виражені ознаки токсичності, які проявлялись деструкцією клітин. На середовищі з використанням сироватки, очищеної за запропонованим способом, клітини без ознак деструкції витримували 40 пасажів і успішно використовувались для накопичення вірусної біомаси Приклад 2. Для перевірки ростових властивостей вищезазначеної сироватки після 12 місяців збереження при температурі 5°С її добавляли у живильне середовище для вирощування перещеплюваної культури клітин FLK-BLV у кількості 10% Цитоморфологічні показники клітин були характерними для цієї культури і не відрізнялись від контрольного варіанту, у якому клітини вирощувались з застосуванням нативної сироватки крові ВРХ. Спосіб очистки сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ) від гамма-глобуліновоі фракції розчином поліетилен гліколю (ПЕГ-6000) та отримання надосадової рідини триразовим низькотемпературним заморожуванням (-20"С) та відтаюванням, з послідуючим збиранням надосадової рідини забезпечує більш повну очистку сироватки крові від остаточної' кількості пол і етилен гліколю. Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Киів-42, 01601