Спосіб одержання білкового гідролізату з крові великої рогатої худоби

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения белкового гидролизата (БГ) из крови крупного рогатого скота (КРС). Полученный белковый гидролизат может использоваться в косметической и фармацевтической промышленности как компонент готовых форм, а также в химической промышленности как полупродукт для синтеза поверхностноактивных веществ. Известны способы получения БГ из сырья животного и растительного происхождения (заявка ФРГ № 3701036, А 61 К 7/48, 1988 г.; заявка ФРГ №4018392, С12 Р19/00, 1991 г., заявка Японии № 62-53909. А 61 К 7/00, 1987 г,). Эти способы базируются на трех основных методах расщепления белка; кислотном, щелочном или ферментативном гидролизе. Метод ферментативного гидролиза является более специфичным и менее энергоемким. Наиболее близким к заявляемому способу получения БГ по источнику сырья и технологии является способ, описанный в заявке Японии г* 63-139113, кл. А 61 К 7/06. Способ осуществляется следующим образом. Добавляя ацетон к плазме крови КРС, удаляют фибриноген, т.е. получают сыворотку крови КРС. Смесью ацетона и эфира в соотношении (1:1) осаждают белковую фракцию. Полученный осадок центрифугируют, сушат, а затем растворяют в воде и проводят ферментативный гидролиз трипсином. Полученный продукт диализуют и диализат концентрируют. К недостаткам вышеописанной технологии можно отнести использование органических растворителей для получения белкового концентрата, использование трипсина - фермента, полученного из сырья животного происхождения. Гомогенный катализ - основа этой технологии - и диализ увеличивают время цикла получения БГ по данной схеме. Анализируя способ полумения БГ по данной схеме можно сделать вывод, что процесс трудоемкий и дорогостоящий. Задачей изобретения является разработка способа получения белкового гидролизата из крови крупного рогатого скота, позволяющего путем осаждения белковой фракции нагреванием, использования летучего буфера для ее осуществления и проведения гидролиза протеолитическими ферментами, продуцируемыми бактериями или грибами, получить препарат с высоким содержанием основного вещества при одновременном упрощении процесса и исключения вредных отходов. Для этого в способе получения белкового гидролизата из крови крупного рогатого скота, включающем осаждение и центрифугирование белковой фракции с последующим ферментативным гидролизом, белковую фракцию осаждают из сыворотки крови КРС путем нагревания ее на водяной бане при постоянном перемешивании, осадок после центрифугирования суспендируют в 0,03 М растворе кислого углекислого аммония при рН - 8,0 и проводят гидролиз протеолитическими ферментами, продуцируемыми бактериями или грибами, после чего фермент ингибируют нагреванием реакционной смеси, непрореагировавшие компоненты отделяют центрифугированием, а полученный гидролизат сушат. Осаждение белковой фракции производят нагреванием сыворотки крови КРС до t 60-90°С в течение 1040 мин. Гидролиз протеолитическими ферментами проводят при t 30-50°С и рН - 7-10 в течение 4-10 ч. В отличие от прототипа в заявляемом способе белковую фракцию осаждают нагреванием без применения органических растворителей, после центрифугирования осадок суспендируют в 0,03 М растворе кислого углекислого аммония, что позволяет исключить стадию диализа, так как при инги-бировании фермента получается бессолевой продукт (NH4HCO3 ®NН3 + СО2 + Н2О). Гидролиз в заявляемом способе проводят протеолитическими ферментами, продуцируемыми бактериями или грибами. Возможность осуществления спосо.ба подтверждается примерами. Пример1.1л сыворотки крови нагревали при перемешивании на водяной бане до 90°С в течение 30 минут. Образовавшийся осадок центрифугировали при 3000 об/мин, 20 мин при комнатной температуре. Осадок суспендировали в 1,2 л 0,03 М NH4HCO3 при рН = 8,0, добавляли в реакционную смесь 2 г протеолитического фермента (Bacillus subtilis) с активностью 200000 ед/r. Гидролиз проводили при температуре t -40°C -8 ч, при постоянном перемешивании. Затем реакционную смесь нагревали до 70°С и выдерживали 20 мин при указанной температуре. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали при t -4°C. Полученный гидролизат сушили. Пример 2. Методическая часть, как в примере 1, рН используемого р-ра NH4HCO3 для суспендирования 7,0. Пример 3. Методическая часть, как в примере 1, рН р-ра NH4HCO3-9,5. Пример 4. Методическая часть, как в примере 1, температура гидролиза г 30°С. Пример 5. Методическая часть, как в примере 1, температура гидролиза - 50°С. Пример 6. Методическая часть, как в примере 1, в качестве протеолитического фермента использовали фермент, продуцируемый грибами Acremonlum chygodenum в количестве 1,5 г с активностью 270000 ед/г. Содержание белков в сыворотке крови КРС составляет 6-8% с молекулярной массой, в основном, 67 кДа и выше (The plasma proteins IV, Acad. Press, 1984, p.4-8). В процессе ферментативного гидролиза их молекулярная масса уменьшается и составляет 0,5-10 кДа. Основными физико-химическими показателями белкового гидролизата являются молекулярные массы смеси пептидного материала и содержание основного материала. Определение основного вещества проводили по методу Лоури (Anal. Blochem, 100,201,1979). Молекулярные массы белкового гидролизата определяли методом жидкостной хроматографии высокого давления на колонке ZORBAX GF-25O 9,4 мм х25 см. (Жидкостная хроматография высокого качества для биохимиков. LKB, HPLC). Для оптимизации процесса получения белкового гидролизата по данному способу был введен показатель выхода продукта определенной молекулярной массы. В табл.1 представлены основные физико-химические характеристики белкового гидролизата (пример 1). Выход продукта 50 г. В табл.2 приведены данные по выходу продукта при разных температурах реакции (30-50°С) и рН (7-9,5). Примеры 1-5. Максимальный выход продукта по заявляемому способу достигается при условиях, приведенных в примере 1. Оптимальным вариантом проведения ферментативного гидролиза являются условия, приведенные в примере Т, В настоящее время во всех технологиях получения Б Г на стадии осаждения белковой фракции из белоксодержащего сырья используют органические растворители или их смеси, соли неорганических кислот высоких концентраций, либо органические кислоты. В заявляемом способе этот вопрос решается без получения вредных отходов, которые необходимо утилизировать или регенерировать. Применение летучего буфера NH4HCO3 в реакционной смеси исключает этап диализа готового продукта и одновременно позво-ляет- получить препарат с высоким содержанием основного вещества (табл.1). Получение белковой фракции и расщепление ее в твердой фазе исключает этапы сушки белковой фракции и последующего растворения ее, как это происходит при гомогенном катализе. Использование гетерогенного катализа с применением протеолитических ферментов, продуцируемых бактериями или грибами, отличает заявляемый способ получения БГ не только от прототипа, но и от всех существующи х те хнологий. Использование протеолитических ферментов уде шевляет способ получения БГ. Заявляемый способ получения БГ не требует создания специального оборудования. Анализ табл. 1 показывает, что препарат белкового гидролизата, полученный по заявляемому способу не уступает по основным показателям прототипу, а по содержанию основного вещества превосходит его.