Карбоксиметиламіди заміщених бензолсульфонілоксамінових кислот, які мають антиоксидантну та протизапальну активність

Карбоксиметиламіди заміщених бензолсульфонілоксамшових кислот загальної формули RSO2NHCOCONHCH2COOH, де R = 2- NO2C6H4 (І а) , 3,5 СІ2 - 4 - NH 2 C 6 H 2 (І б), які мають антиоксидантну та протизапальну активність доліки цього препарату такі як ацетат атокоферолу здатний викликати при внутрім'язових ІН'ЄКЦІЯХ креатинурію, зниження працездатності, утворювання інфільтрату, алергічні реакції, а також відрізняється болючим введенням препарату та дорожнечею В зв'язку з цим дослідження нових ефективних фармакотерапевтичних засобів, які мають антиоксидантну активність є одним з надбаних напрямків сучасної фармацевтичної хімії та фармакології [2] На СЬОГОДНІШНІЙ день питанню пошуку протизапальних препаратів не стероїдної структури приділяється виключно більш уваги Це пов'язано з тим, що протизапальні засоби стероїдної групи викликають порушення гормонального балансу в організмі, а внаслідок чого - різного роду захворювання Широке застосування в медичній практиці знайшли не стероїдні протизапальні препарати такі як ПОХІДНІ фенілоцтової кислоти, зокрема диклофенак [1] Проте він виявляє ульцерогенну дію чим викликає ряд ускладнень, які виявляються з боку шлунково-кишкового тракту, системи крові, функції нирок, нервової системи, шкіри Ці недоліки знижують терапевтичну ЦІННІСТЬ диклофенака ВІДОМІ також метилові ефіри аренсульфонілоксамшових кислот загальної формули [3] Ar-SO2NHCOCOOCH3, де Аг = 3-NO2C6H4, 4NO2C6H4, 3-HOOCC6H4, 4-СН3ООСС6Н4, 3,5-СІ2-4NH2C6H2, які є близькими структурними аналогами запропонованих сполук, але вони не виявляють ан 1 ю 47157 тиоксидантної і протизапальної активності В якості прототипу вибрані рдиметиламшоетиламіди аренсульфонілоксамшових кислот загальної формули [4] R-SO2NHCOCONHCH2CH2N(CH3)2, де R = С6Н5, 4-СІС6Н4, 4-NO2C6H4, 3,5-Cl2-4-NH2C6H2, які є найбільш близькими структурними аналогами запропонованих сполук, але вони не проявляють антиоксидантної і протизапальної активності Задачею винаходу є пошук нових речовин, які проявляють збільшену антиоксидантну і протизапальну активність та мають низьку токсичність Поставлена задача вирішується синтезом карбоксиметиламідів заміщених бензолсульфонілоксамінових кислот загальної формули RSO2NHCOCONHCH2COOH, де R = 2-NO2C6H4 (la), 3,5-CI2-NH2C6H2(16), які мають антиоксидантну та протизапальну активність Синтез цих сполук здійснювали за схемою N 2 HC O HC 2 O H R CJ C C O H S yH O O C , RSOJNHCQCONHCHJCOOH Іа,б Синтез оснований на амідуванні метилових ефірів заміщених бензолсульфонілоксамінових кислот амінооцтовою кислотою в присутності лугів при кімнатній температурі При подальшому підкислені утворюються цілеві продукти з виходом до 75% Це безбарвні кристалічні речовини, які розчиняються у водневих лугах та більшості органічних розчинників Будова синтезованих сполук підтверджена елементним аналізом та даними ІЧспектроскопм, чистота та індивідуальність - методом тонкошарової хроматографії Винахід ілюструється прикладами Приклад 1 Синтез карбоксиметиламіду 2 нітробензолсульфонілоксамінової кислоти (Іа, табл 1) До розчину 1,12г (0,02Моль) калію гідроксиду в 5мл води додають 1,5г (0,02Моль) амінооцтовой кислоти Одержаний розчин додають до розчину 2,88г (0,01 Моль) метилового ефіру 2нітробензолсульфонілоксамінової кислоти в 5мл діоксану і залишають до зникнення лужного середовища До реакційної суміші додають воду до розчинення осаду і підкисляють НСІ (1 1) до рН2 Осад відфільтровують, висушують і кристалізують Вихід 2,50Г Аналогічно одержують речовину Іб, табл 1 Приклад 2 Антиоксидантні властивості сполук Іа і Іб визначали на моделі аутоокислення метилових ефірів насичених жирних кислот, ініційовано2+ го іонами Fe В якості джерела метилових ефірів поліненасичених жирних кислот використовували маслинову олію, яка містить суміш ненасичених жирних кислот Для оцінки впливу досліджуваних речовин на процеси перекісного окислення ЛІПІДІВ (ПОЛ) використовували метод [5] До 0,5мл маслинової олії додавали 0,25г Твина-80 і суміш озвучували в 4,25мл фосфатного буфера (0,05Моль, рН7,4) на ультразвуковому диспергаторі УЗДН-2Т (СССР) протягом 5хв при частоті 20кГц Потім до 0,5мл одержаної дисперсії ЛІПІДІВ додавали 0,05мл розчину препарату відомої концентрації так, що молярне співвідношення в середовищі інкубації ЛІПІДІВ речовина складає 500 1 Суміш доводили до об'єму 4,5мл фосфатного буфера (0,05Моль) і стимулювали ПОЛ внесенням 0,5мл 0,14% водного розчину FeSO4 x 7Н2О (концентрація Fe2+ в середовищі інкубації складає 500мМоль) Одержану суміш шкубували при 37°С і через 20, 40, 60 хвилин відбирали Таблиця 1 Характеристики карбоксиметиламідів заміщених бензолсульфонілоксамінових кислот (Іа, Іб) RSO2NHCOCONHCH2COOH Сполука Іа R Вихід г % 2,50 75,5 Вирахувано, % Т пл , Знайдено, % Емпірична формула Rf** °С* N S N S 195-6 12,40 9,42 CioHgNsOsS 12,68 9,68 0,80 20911,10 8,41 11,35 8,66 0,74 C10H9CI2N3O6S 10 2-NO2C6H4 3.5-СІ2-416 2,68 72,4 NH2C6H2 *) Розчинник для кристалізації вода **) Хроматографічні константи Rf визначені на платівках "Silufol" в системі розчинників етанол, гексан, хлороформ (1 1 1), проявлення хроматограм здійснювали обробкою парою йоду ІЧ-спектри, см 1 Іа - 3370, 3250 (NH), 3050 (ОН), 2950, 2850 (СН2), 1720 (CO), 1560, 1320 (NO2), 1550 (5NH), 1340, 1160 (SO2) Іб - 3360, 3240 (NH), 3040 (ОН), 2930, 2880 (СН2), 1715 (СО), 1482 (5NH), 1320, 1160 (SO2), 880, 840(C-CI) аліквоти по 0,05мл для визначення ліпоперекисей В холосту пробу замість суспензії ЛІПІДІВ додавали ВІДПОВІДНИЙ об'єм фосфатного буфера Контролем є суміш, яка не містить додатка антиоксидантів або досліджуємої сполуки Інтенсивність протікання процесів ПОЛ оцінювали по вмісту ліпоперекисей в середовищі інкубації в динаміці по методу [6] До 0,05мл інкубаційного середовища додавали 0,2мл 8,1% водного розчину натрію д од еци л сульфату, 1,5мл ацетатного буфера (2Моля, рНЗ,5), 1,5мл 0,8% водного розчину тюбарбітурової кислоти і 1,0мл дистильованої води Суміш перемішували і шкубували протягом години при 95°С на водяній бані в закупорених пробірках Потім пробірки охолоджували, додавали 1,0мл води дистильованої 5,0мл суміші бутанол піридин (15 1 по об'єму) і інтенсивно збовтували протягом Зхв Вміст переносили в центрифужні пробірки і центрифугували 5хв при 3000 оборотів в хв Оптичну ЩІЛЬНІСТЬ верхнього забарвленого шару фотометрували проти холостого досліду на спектрофотометрі СФ-46 при дов 5 47157 6 жині хвилі 532нм Результати ДОСЛІДІВ обробляли еталонного препарату (ацетату а-токоферолу) в статистичне за допомогою критерію Стьюдента динаміці представлені в таблиці 2 Одержані при експерименті данні про вивчення антиоксидантної активності заявлених сполук і Таблиця 2 Антиоксидантна активність заявлених сполук і еталонного препарату (ацетату а-токофоролу) в динаміці Вміст ліпоперекисей (в ед опт ЩІЛЬНОСТІ) в різні строки вивчення, в хвилинах + 0 (до внесення в середовище Fe^ ) 20 40 60 Контроль (без додавання антиокси0,064 0,210 0,332 0,451 данту) 0,005 0,012 0,021 0,028 0,041 0,156 0,201 0,248 Еталон (ацетат а-токоферолу) 0,002 0,009 0,011 0,021 Pi < 0,05 Рі < 0,05 Рі < 0,05 Рі < 0,05 0,038 0,118 0,166 0,224 0,002 0,008 0,016 0,018 la Рі < 0,05 Рі < 0,05 Рі < 0,05 Рі < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 0,035 0,130 0,158 0,207 0,003 0,010 0,014 0,015 Іб Рі < 0,05 Рі < 0,05 Рі < 0,05 Рі < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Примітка Рі - дано в порівнянні з контролем Р2 - дано в порівнянні з еталоном Сполука Як видно з наведених даних обидві заявлені сполуки викликають достовірне (Р < 0,05) зниження рівню продуктів ПОЛ в інкубаційному середовищі не тільки в порівнянні з контролем (без додавання антиоксиданту), але що особливо важливо в значній ступені (Р < 0,05) перевершують по антиоксидантній активності і еталонний препарат (ацетату а-токоферолу) в усі строки вивчення (20, 40 і 60 хвилин) Так, як видно з таблиці, сполука Іа знижує інтенсивність ПОЛ, а значить і накопичення в середовищі інкубації продуктів ліпідпереокислення в різні строки спостереження на 20 - 25% в зрівнянні з еталонним препаратом - ацетатом токоферолу При цьому необхідно ВІДМІТИТИ, що 1 година спостереження ефект препарату зберігається на достовірно значимому рівні Сполука Іб також проявляє виявлену антиоксидантну активність, яка реалізується в зниженні утворювання і накопичення продуктів ПОЛ на 18 - 22%, при цьому Р < 0,05, що свідчить про високу антиоксидантну активність заявленої сполуки Таким чином, проведена серія досліджень показала, що заявлені сполуки Іа і Іб мають виявлену антиоксидантну активність, яка перевищує для відомого антиоксиданту ацетату а-токоферолу Приклад 3 Протизапальну активність досліджуваних сполук Іа и Іб вивчали на моделі гострого запального набряку, який викликаний субплантарним введенням в задню лапку щура 0,1 мл 10% суспензії каоліну Дослідження виконані на безпородних білих щурах масою 140 - 170г по 7 тварин в дослідних і контрольних групах Вимір об'єму лапки здійснювали за допомогою онкомера до начала досліду та в момент максимального розвитку набряку (4 години) Досліджувані речовини вводили в дозі 0,01ЛДбо внутрючеревинно за ЗОхв до введення флогогенного агента Ступень гноблення набряку розраховували за формулою Ук - Уо % ГНОБЛЕННЯ = •- хіОО, Ук де Ук и Уо ВІДПОВІДНО об'єм лапки в контролі та в ДОСЛІДІ [7, 8] В якості препарату зрівняння вибраний диклофенак Результати одержаних експериментальних даних представлені в таблиці З Таблиця З Протизапальна активність та гостра токсичність карбоксиметиламідів заміщених бензолсульфонілоксамінових кислот (Іа, б) RSO2NHCOCONHCH2COOH Сполука Доза, мг/кг Іа 38 Іб 38 Приріст об'єму лапки через 4 години Довірчій інтервал при Р В % до контМ + т = 0,05 ролю 0,68 + 0,53 ч-0,83 46,5 0,06 0,62 + 0,43 ч-0,79 42,5 Протизапальна активність, % 53,5 57,5 47157 7 Диклофенак 8 Контроль 0,07 0,72 + 0 06 1,46 + 0,08 8 0,57-ьО,87 49,3 50,7 1,26-ь1,66 100 З даних таблиці 3 видно, що сполуки Іа і Іб викликають зменшення запального набряку по відношенню до контролю на 53,5 і 57,5% ВІДПОВІДНО, в той час як гноблення запалення в дослідах з диклофенаком складає в середньому 50,7% Таким чином, вивчені нові сполуки формули Іа і Іб перевершують протизапальну активність високоефективного препарату диклофенак, який широко застосовується в медичній практиці Приклад 4 Вивчення гострої токсичності досліджуваних речовин Іа, б проведено в дослідах на білих безпородних щурах обох статей масою 18 24г Речовини вводили тваринам внутрючеревинно у виді 3 - 5% тонкодисперсної водної суспензії, стабілізованої твином-80 Кожну дозу досліджували на 5 тваринах 3 метою вивчення і одержання необхідної інформації про летальні і максимально переносимі дози цих сполук, виявлення картини отруєння, а також широти терапевтичної дії, за тваринами проводили спостереження протягом 14 днів після однократного введення КІЛЬКІСТЬ загиблих і виживших тварин реєстрували через кожні 24 години ЛДбо розраховували по методу Кербера [9, 10] В дослідах на щурах встановлено, що ЛД50 при внутрючеревенному введенні складає 3820мг/кг для сполуки Іа і 3840мг/кг - для сполуки Іб Таким чином, заявлені сполуки Іа і Іб в 21 раз менш токсичні, чім широко застосовуваний в медичній практиці еталонний препарат диклофенак і, згідно з класифікацій К К Сидорова [11], відносяться до відносно нешкідливим Висновок Досліджувані сполуки формули Іа, б представляють собою інтерес для подальших доКЛІНІЧНИХ досліджень з метою створення на їх основі нових ефективних і безпечних антиоксидантних і не стероїдних протизапальних засобів з низькою токсичністю Заявлені сполуки можуть бути також використані в харчової промисловості і сільському господарстві в якості консервантів харчових продуктів і кормових добавок для попередження їх окислення Джерело інформації 1 Машковский М Д Лекарственные средства//Харьков Торсинг, 1997 - Т 1 - 736с-Т 2 688с 2 Чекман И С Осложнения фармакотерапии//Киев «Здоров'я» -1980 -236с 3 Авторское свидетельство СССР №1088297, кл С07С143/78, 5 07 82г, н/п 4 Авторское свидетельство СССР №1107519, кл С07С143/78, 30 12 82г, н/п 5 Fernandez H , Valevsela A , Fernandez V Effect of Dietil maleate and glutatione on Imohate peroxidation //Lipids, -1982/ -17, №5 /- P 393 - 395/ 6 Okhawa H , Ohimski N , Cogik F Assay for hpid peroxidase tioanimal tissuls by thiobarbitunc acid reaction //Anal Biochem - 1979 - 95, №2/ - P 351 358 7 Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ, предлагаемых в качестве нестероидных противовоспалительных средств/С М Дроговоз, Н А Мохорт, И А Зупанец и др - Киев ФКМЗ Украины, 1994 -46с 8 Фармакологическая регуляция воспаления/Ф П Тринус, Б М Клебанов, И М Ганжа и др - Киев Здоров'я, 1987 - 144с 9 Беленький М Л Элементы количественной оценки фармакологического эффекта//2-е изд Л Медицина, 1963 - 148с 10 Прозоровский В Б Использование наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности//Фармакол Итоксикол -1962 - Т 25, №1 -С115-118 11 Сидоров К К О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения Токсикология новых промышленных веществ - М , 1973 -№13 -С 47-51 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71