Спосіб визначення хімічної сумісності біологічно активних речовин за допомогою мас-спектрометрії

Спосіб визначення хімічної сумісності біологічно активних речовин за допомогою масспектрометри, що полягає у аналізі мас-спектрів сумішей, отриманих методом часопролітної плазмово-десорбційної мас-спектрометри за характером, інтенсивностями та співвідношенням ПІКІВ ІОНІВ, який відрізняється тим, що в процесі підготовки зразків додатково застосовують модифікуючі фактори 1-10% водні розчини органічних кислот винної, сульфанілової або лимонної, речовини із радюпротекторними властивостями - аскорбінову кислоту, цистеїн або триптофан, матриці з лактози або пропіленгліколю Винахід відноситься до ветеринарної фармакологи, зокрема до експрес-визначення фармацевтичної сумісності біологічно активних речовин (БАР) в процесі розробки і випробувань нових багатокомпонентних лікувально-профілактичних препаратів для ветеринарної медицини, а також моніторингу стану БАР у офіціальних і магістральних препаратах Аналогами даного способу є хіміко-фармацевтичний аналіз діючих речовин у багатокомпонентних препаратах [Государственная фармакопея СССР Вып 2 Общие методы анализа /МЗ СССР 11-е изд - М Медицина, 1990- 336 с ] і мас-спектрометричне вивчення органічних сполук при "м'якому" типу іонізації уламками ділення ядер каліфорнію-252 [Torgerson D F , Skowronski R P and Macfarlane R D New Approach to the Mass Spectroscopy of Non-volatile Compounds // Biochemical and Biophysical Research Communications- 1974V60, №2,-P 616-621] У фармацевтичній хімії для визначення хімічної сумісності інгредієнтів використовуються , як правило, ЯКІСНІ ХІМІЧНІ реакції, вони орієнтуються на зміни органолептичних показників (кольору, запаху, газовиділення, помутніння, випадіння осаду, тощо) При цьому досить складним залишається питання підбору високоспецифічних реакцій та індикаторів [Фармацевтический анализ лекарственных средств / Шаповалова В А , Заболотний В А , Депеппсо И Т и др - Харьков ИМП «Рубикон», 1995 -400 с 1 Хроматографія, електрофорез, спектроскопія ультрафіолетової та видимої областей спектру, ІНШІ фізико-хімічні способи у більшості випадків можуть лише констатувати незмінність або навпаки - наявність ХІМІЧНИХ перетворень, що відбуваються з молекулами БАР у сумішах Головним недоліком цих способів є те, що вони не дають однозначної оцінки імовірних продуктів ХІМІЧНИХ реакцій, а дозволяють лише припускати, що молекула БАР зазнала певних змін, зруйнувалася або увійшла до складу міжмолекулярних комплексів, нековалентно зв'язаних гомо- або гетероасоціатів, хелатів, тощо, не даючи їх розшифровки Скринінг фармакологічно доцільних комбінацій БАР традиційними методами досить тривалий у часі Прототипом слугує часопролітна шіазмово-десорбційна мас-спектрометрія (ГЩМС) в такій м технічній реалізації, як прилад МСБХ-01 Існуючий ПДМС-метод аналізу використовується переважно Ефи дослідженні високомолекулярних органічних сполук з молекулярною масою (М) в декілька тисяч, або десятків тисяч атомних одиниць маси (а о м ), це протеїни, ліпопротеши, нуклеопротеши, полінуклеотиди, тощо [Sundqvist B U R , Hakansson Р , Hedm A Plasma Desorption Mass Spectrometry Achievments and Frontiers // Methods and Mechanisms for Producing Ions from Large Molecules - New York Plenum Press, 1991 - P 232, Macfarlane R D , Hu Z -H , Song S Cf-252 - Plasma Desorption Mass Spectrometry 11-A Perspective of New Directions //Biol Mass Spectrom- 1994 Y 23-P 117-130] Вивченню стану молекул БАР з М від 100 до 2000 47720 а о м практично не приділяється належної уваги, в той час, як переважна більшість фармакологічних препаратів має М, що знаходяться саме у ньому діапазоні Експериментатори відзначають, що визначити можливі зміни структури БАР їх міжмолекулярні взаємодії не тільки in vivo, але і in vitro надзвичайно складно [Суходуб Л Ф Возможности мягкоионизационной масс-спектрометрии в молекулярно-биологических исследованиях // Биополимеры и клетка -1991 - Т 7, №6 - С 15-32] Основною складністю і недоліком є те, що далеко не завжди на мас-спектрах чистих речовин та їх композицій вдається отримати ЧІТКІ ПІКИ молекулярних (МІ) і квазімолекулярних ІОНІВ (КМГ) речовин, а без них оцінити стан молекул БАР у сумішах, визначити їх можливі зміни і взаємодії, практично неможливо Це ускладнює підбір інгредієнтів при розробці та випробовуванні нових препаратів, гальмує скринінг фармакологічно доцільних сумішей В основу винаходу поставлено задачу розробити ефективний експрес-спосіб визначення хімічної сумісності БАР при конструюванні нових лікувально-профілактичних препаратів мас-спектрометричним (МС) способом шляхом удосконалення процесу пробопідготовки в ПДМС з використанням ряду модифікуючих факторів Для ефективного визначення хімічної сумісності сполук у різних середовищах необхідно створити умови, які забезпечують отримання на мас-спектрах чітких ПІКІВ МІ, КМІ, характерних аддуктів, комплексів, похідних Ці умови (фактори) не повинні спотворювати реальну картину стану молекул БАР у сумішах Спосіб визначення хімічної сумісності біологічно активних речовин за допомогою мас-спектрометри полягає у аналізі мас-спектрів ПДМС сумішей за характером, інтенсивностями та співвідношенням ПІКІВ ІОНІВ, згідно винаходу в процесі підготовки іонізації і збільшення виходу цілих ІОНІВ, аддуктів та слабостійких міжмолекулярних зразків додатково застосовують модифікуючі фактори - 1 - 10% водні розчини органічних кислот винної, сульфанілової або лимонної, речовини із радюпротекторними властивостями аскорбінову кислоту, цистеїн або триптофан, матриці з лактози або пропіленгліколю Додавання невеликої КІЛЬКОСТІ слабоконцентрованих (1 - 10%) розчинів таких органічних кислот, як винна (1,2-диоксиянтарна), сульфанфюва, лимонна (2-окси-1,2,3-пропантрикарбонова) або деяких інших веде до зменшення фрагментації органічних молекул та міжмолекулярних комплексів і підвищення виходу ІОНІВ в процесі десорбціі/юнізацм Речовини із радюпротекторними властивостями, серед яких аскорбінова кислота, амінокислоти цистеїн або триптофан та деяіф ІНШІ захищають молекули органічних сполук від зайвої руйнації, під час іонізації зразка важкими уламками ділення ядра атому каліфорнію-252 Матриці з дисахаридів, зокрема лактози (4-О-[р-0-галактошранозил]-О-глюкошраноза), або двохатомного спирту пропіленгліколю послабляють міжмолекулярні зв'язки і, ВІДПОВІДНО, зменшують міжмолекулярні взаємодії БАР, що часто призводять до сильної фрагментації молекул в процесі десорбціі/юнізапм Запропонований спосіб дозволяє об'єктивно оцінювати стан речовин і відповідає основним вимогам фармацевтичного аналізу чутливість, експресність, специфічність, вибірковість і точність ідентифікації речовини за такою її фундаментальною фізичною характеристикою, як молекулярна маса Спосіб здійснюється наступним чином Спочатку знімаються мас-спектри чистих речовин, при цьому підбираються такі умови пробопідготовки, за яких на спектрах обов'язково присутні МІ або КМІ, з'ясовується будова характерних фрагментів, що виникають в процесі десорбції/іонізації Для збільшення виходу характеристичних ІОНІВ, В залежності від будови і властивостей БАР, використовуються такі модифікуючи фактори, як додавання невеликої КІЛЬКОСТІ слабоконцентрованих (1 - 10%) розчинів органічних кислот (винна, сульфанилова, лимонна чи деякі ІНШІ) або речовин із радюпротекторними властивостями (аскорбінова кислота, амінокислоти цистеїн або триптофан) Застосування в якості матриць, крім традиційної для ПДМС нітроцелюлозної, молочного цукру -лактози або пропіленгліколю веде до зменшення міжмолекулярних взаємодій, що часто призводять до значної фрагментації молекул БАР в процесі десорбції/іонізації Після цього компонуються фармакологічно виправдані суміші БАР, які витримуються необхідний час у розчинах із контрольованим значенням кислотності і певному температурному і світловому режимі Завдяки модифікуючим факторам процес іонізації зразків в ПДМС "пом'якшується" і мало, порівняно з іншими типами іонізації, руйнує молекули БАР та міжмолекулярні комплекси Отримані за допомогою іонізації уламками ділення каліфорнію-252 (частіше за все це технецій-106 із зарядом +22 і енергією 104МеВ і барій-142 із зарядом +18 і енергією 79МеВ) масспектри дозволяють детально визначити стан молекул БАР у сумішах Нанесеш на пробонесучий диск зразки вміщуються у аналітичну камеру часопролітного масспектрометру МСБХ-01 із радіоактивним джерелом іонізації Один з уламків ділення каліфорнію252 бомбардує зразок, викликаючи десорбцію його часток, в той час як другий, протилежноспрямований, потрапляє на стартовий детектор і використовується для запуску часопролітних вимірювань Іони, десорбоват із зразку, прискорюються потужним електричним полем (від -25 до +25кВ) і потрапляють у безпольовий простір, де дрейфують і розподіляються за швидкостями і, ВІДПОВІДНО, масами Після проходження еквіпотенціального простору вони потрапляють на стоповий детектор, де зупиняють ВІДЛІК часу За часом прольоту юна визначається його масове число На мас-спектрі по осі абсцис реєструються значення m/z (співвідношення маси m юну до його заряду z), по осі ординат - ВІДЛІК інтенсивності ПІКІВ в умовних одиницях Мас-спектри експериментальних сумішей і магістральних рецептів ретельно порівнюються із спектрами чистих речовин або офіцинальних препаратів, ідентифікуються всі наявні піки, як ті, що належать вихідним сполукам, так і можливим новоутворенням За характером спектру визнача 47720 ється стан молекул БАР у сумішах Це дозволяє визначати фармацевтичну сумісність сполук, що вивчаються, у експериментальних сумішах та офіцинальних багатокомпонентних препаратах різних лікарських форм МС-аналіз проводиться за піками МІ, КМІ, характерних фрагментів молекул, молекулярними асоціатами і адцуктами сполук Спосіб ілюструється наступними прикладами При створенні нових антибактеріальних препаратів було випробувано декілька комбінацій БАР, у тому числі і суміш антибіотику граміцидшу С з антисептиком декаметоксином (1,10-Декаметилен-біс-fN- диметил-(карбментоксиметил)-амоній] дихлорид) При змішуванні цих сполук органолептичне у розчині помітних змін не зафіксовано На мас-спектрі чистого декаметоксину крім його катіону КМІ [М-СІ]+ m/z 657,5 присутні ряд ПІКІВ, ЩО належать характерним фрагментам молекули, які утворюються в процесі десорбцм/іотзацм зразка, це m/z 242, 287, 425, 483,7 (фіг 1) Даний набір ПІКІВ Є своєрідною «візитною карткою» декаметоксину На мас-спектрі суміші декаметоксину з антибіотиком грамщидшом С (фіг 2), що була витримана певний час при необхідній температурі у розчиннику з виправданим іонним складом і значенням рН, більшість типових ПІКІВ декаметоксину зникла або їх інтенсивність значно зменшилася, а пік молекулярного юну антибіотику розшарувався натри складові з m/z 1139,4, 1159,5 і 1178,4 Результати МС-аналізу свідчать про недоцільність поєднання даних БАР в одному комплексному препараті При розробці нового комплексного протипаразитарного препарату необхідно було визначити хімічну сумісність двох антигльмінтиків - левамізолу пдрохлориду (М = 204 а о м ) і оксибендазолу (М = 249 а о м), вони вибірково діють на різні групи гельмінтів В якості наповнювача, а також матрицеформуючого компоненту, що покращує вихід МІ і КМІ цих БАР, було використано молочний цукор лактозу (М = 342 а о м ) На мас-спектрі їх суміші фігЗ) присутні характерні для обох діючих сполук піки M/z 204 належить молекулярному юну [Щ+ левамізолу, m/z 249 - МІ [М\+ оксибендазолу, m/z 265 -пдратований оксибендазол або албендазол, m/z 365 - КМІ лактози з катіоном лужного металу [М + Na]+, m/z 409 належить гомоасоціату або подвійному однозарядному юну левамізолу [2М+Н) , m/z 469 є гетероасоціатом двох молекул різних антгельмштиків -левамізолу і албендазолу, m/z 498 - гомоасоціат оксибендазолу [2М]+ Порівняння з мас-спектрами чистих речовин показало, що у суміші дані БАР не зазнали суттєвих змін, фармацевтичне вони сумісні, гетероасоціат левамізолу і албендазолу не може вплинути негативно на антгельмінтні властивості обох сполук Таким чином можна зробити висновок про ДОЦІЛЬНІСТЬ поєднання цих сполук в одному комплексному препараті, що зменшить загальне хімічне навантаження на організм тварини і одночасно підвищить ефективність лікуванння при змішаних гельмінтозах Використання запропонованого способу визначення хімічної сумісності БАР методом ПДМС дозволить швидко і точно визначати стан їх молекул у сумішах і таким чином теоретично і експериментально обґрунтувати фармацевтичну ДОЦІЛЬНІСТЬ тих чи інших фармакологічно виправданих композицій шгредієнтів при розробці нових лікувально-профілактичних препаратів Значно полегшується пошук допоміжних речовин, ефективних стабілізаторів, наповнювачів, пролонгаторів Д" ФІГ. 1 47720 Фіг. 2 Фіг. З ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71