Спосіб модифікації поверхні золота для імобілізації біологічних молекул

Спосіб модифікації поверхні золота для імобілізацм біологічних молекул, що включає формування на поверхні золота проміжного моношару та його хімічної модифікації, який відрізняється тим, що моношар формують з соєвого інгібітору трипсину при рН 5 - 6 з наступною обробкою глутаровим альдегідом вності Найбільш близьким до запропонованого винаходу є спосіб імобілізацм біологічних молекул [8], що передбачає спеціальну модифікацію поверхні золота для забезпечення подальшої імобілізацм бюмакромолекул із збереженням біологічної активності білка — об'єкта досліджень, який ми й обрали за прототип Спосіб модифікації включає формування на поверхні золота моношару омега-меркаптогексадеканолу, його активацію з використанням епіхлорпдрину та дигліму, ковалентне приєднання водорозчинного декстрана до «активованої поверхні», перетворення імобілізованого декстрану на карбоксиметил-декстран, карбоксильні групи якого після хімічної «активації» можна використати для імобілізацм білка — об'єкта досліджень Спосібупрототипу властиві складність контролю процесу модифікації поверхні золота звичайними аналітичними методами, висока вартість, складність виконання Спосіб потребує застосування органічних розчинників, розчинів з екстремальними рН, деяких шкідливих реагентів, досить складного устаткування Вказані недоліки істотно обмежують використання цього способу для рутинних ДОСЛІДІВ методом ППР В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу удосконалення способу модифікації поверхні золота шляхом формування проміжного білкового моношару з наступною його модифікацією для імобілізацм біологічних молекул на його поверхні без порушення нативної конформації, забезпечуючи спрощення способу модифікації та 1 СО Ю 00 48537 контролю за перебігом цього процесу, а також зменшення вартості виконання способу Поставлена задача вирішується тим, що в способі модифікації поверхні золота, що включає формування проміжного моношару та його модифікацію, згідно з винаходом, проміжний білковий моношар формують з соєвого інгібітору трипсину при рН 5-6, а модифікують глутаровим альдегідом Створення на поверхні золота мономолекулярного шару невеликого високостабільного білка — соєвого інпбітора трипсину [9] запобігає безпосередньому контакту об'єктів дослідження з металевою поверхнею, а подальша прошивка глутаровим альдегідом [10] стабілізує шар соєвого інгібітору трипсину Надлишкові альдегідні групи, що не взяли участі в утворенні цих зшивок, служать для імобілізацм білків чи інших лігандів з первинними аміногрупами У випадку імобілізацм лігандів з вуглеводними залишками використовуються власні аміногрупи соєвого інгібітору трипсину Надлишкові альдегідні групи, що не взяли участі в утворенні цих зшивок, служать для імобілізацм білків чи інших лігандів з первинними аміногрупами Увипадку імобілізацм лігандів з вуглеводними залишками використовуються власні аміногрупи соєвого інгібітору трипсину[11] Запропонований спосіб модифікації поверхні золота для імобілізацм на ній біологічних молекул передбачає застосування дешевого білка рослинного походження—соєвого інпбітора трипсину, а також недорогих реагентів, що широко застосовуються в біологи Загальна КІЛЬКІСТЬ реагентів значно скорочується в зв'язку з відсутністю декількох стадій обробки поверхні золота, порівняно з прототипом Спосіб не потребує складного коштовного устаткування чи створення спеціальних умов Виходячи з наведеного, можна зробити висновок про простоту та доступність запропонованого методу для рутинного використання в біотехнологм, медицині та аналітичній біохімії Всі етапи модифікації та імобілізацм ліганду, передбачені способом, що заявляється, можуть бути виконані безпосередньо в кюветі спектрометра ППР і проконтрольовані за допомогою цього приладу, що спрощує контроль процесу модифікації Отже, спосіб модифікації поверхні золота, що заявляється, поєднує простоту і невисоку вартість з ефективною імобілізацією біологічних макромолекул при забезпеченні їх нативної конформації Запропонований спосіб модифікації виконується згідно наведених прикладів Приклад 1 Розчин соєвого інгібітору трипсину (0 5мг/мл) в 0 1М натрій-ацетатному буфері, рН 5 5, пропускали через кювету спектрометра ППР, в якій встановлено сенсорний чіп з золотою плівкою, протягом 50хв , промивали кювету тим самим буфером протягом Юхв , пропускали через кювету 15%-ий розчин глутарового альдегіду в 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7 3, протягом ЗОхв , промивали кювету 0,01 М натрій-ацетатним буфером, рН 5 5, протягом 1-Зхв (до видалення глутарового альдегіду з кювети, за відгуком спектрометра ППР) Типова сенсограма, що відображає формування моношару соєвого інгібітору трипсину представлена на фіг 1 Приклад 2 Розчин соєвого інгібітору трипсину (0 5мг/мл) в 01М натрій-ацетатному буфері, рН 6 0, пропускали через кювету спектрометра ППР, в якій встановлено сенсорний чіп з золотою плівкою, протягом бОхв , промивали кювету тим самим буфером протягом Юхв, пропускали через кювету 15%-ий розчин глутарового альдегіду в 0 05М натрій-фосфатному буфері, рН 7 3, протягом ЗОхв , промивали кювету 0 01М натрій-ацетатним буфером, рН 5 5, протягом 1-Зхв (до видалення глутарового альдегіду з кювети, за відгуком спектрометра ППР) З наведених прикладів очевидно, що, порівняно з прототипом, КІЛЬКІСТЬ стадій модифікації та КІЛЬКІСТЬ необхідних реактивів скорочена, завдяки чому значно спрощується виконання способу Використання способу пояснюють приклади 36 Як видно з таблиці, для імобілізацм білків на поверхні золота, модифікованій згідно способу, що заявляється, оптимальна величина рН становить 55 Таблиця Оптимізація умов імобілізацм сироваткового альбуміну на поверхні золота, модифікованій соєвим інгібітором трипсину та глутаровим альдегідом рН 90 55 40 73 відгук ППР на імобілізацію білку, кутові хвилини 5 1±0 6 20±5 1 2 2±0 4 6 0±10 9 Приклад 3 Поверхню золота модифікували згідно прикладу 1 Розчин сироваткового альбуміну людини (0,5мг/мл) в 0,01 М натрій-ацетатному буфері, рН 5 5, пропускали через кювету спектрометра ППР протягом бОхв , промивали кювету тим самим буфером протягом 15хв Сенсограма показана на фіг 2 Приклад 4 Поверхню золота модифікували згідно прикладу 1 Розчин імуноглобуліну класу G кози (Ig G) (0 2мг/мл) в 001М натрій-ацетатному буфері, рН 5 5, пропускали через кювету спектрометра ППР протягом бОхв , промивали кювету тим самим буфером протягом 15хв Сенсограма показана на фіг 2 Приклад 5 Поверхню золота модифікували згідно прикладу 2 Розчин альфа-кристаліну кришталика ока великої рогатої худоби (0,5мг/мл) в 0,01 М натрій-ацетатному буфері, рН 5 5, пропускали через кювету спектрометра ППР протягом 60 хв , промивали кювету тим самим буфером протягом 15хв Сенсограма показана на фіг 2 Приклад 6 Зв'язування специфічних антитіл з імобілізованим антигеном Сироватковий альбумін людини (ЛСА) імобілізовали, як описано в прикладі З Далі пропускали 0,05мг/мл розчин політональних антитіл класу G проти ЛСА в 0.05М натрійфосфатному буфері, рН 7 3, протягом 90хв Сенсограми зв'язування антитіл проти ЛСА, а також неспецифічних антитіл представлені на фіг 3 Молекулярне співвідношення (розраховані з відгуків ППР), в якому взаємодіяли імобілізований ЛСА із 48537 специфічними до нього політональними антитілами класу G, становило 1 0 82 Отже, більшість молекул сироваткового альбуміну, імобілізованих на модифікованій даним способом поверхні, зберігає здатність зв'язуватись із специфічними антитілами Наведені приклади свідчать, що запропонований спосіб забезпечує ефективну імобілізацію білків на поверхні золота із збереженням ними здатності брати участь в специфічній взаємодії з водорозчинним партнером Фіг 1 На фіг 1 представлено приклад типової сенсограми, одержаної методом ППР, що описує кінетику формування моношару соєвого інгібітору трипсину на поверхні золота (Цифрами біля стрілок позначено 1 - момент введення розчину соєвого інгібітору трипсину (0 5мг/мл) в 0,1М натрійацетатному буфері, рН 5 5, 2 - момент заміни розчину білка на чистий буфер) Фіг 2 На фіг 2 зображено сенсограми, одержані методом ППР, які відображають кінетику імо білізацм білків на поверхні золота, модифікованій соєвим інгібітором трипсину та глутаровим альдегідом (Квадрати - Ig G (0 2мг/мл), ЛІНІЯ ~ секристалін (0 5мг/мл), трикутники - ЛСА (0 5мг/мл), цифрами біля стрілок позначено 1 - момент введення розчину білка в 0 01М натрій-ацетатному буфері, рН 5 5, 2 - момент заміни розчину білка на буфер) Фіг 3 На фіг 3 наведено приклади сенсограм, одержаних методом ППР, які відбивають кінетику зв'язування політональних антитіл кози проти ЛСА (специфічні антитіла, позначено трикутниками) та аналогічних антитіл проти імуноглобуліну класу М (контроль, позначено колами) з імобілізованим антигеном (ЛСА) (Цифрами біля стрілок позначено 1 - момент введення розчину антитіл (0 05мг/мл) в 0 05М натрій-фосфатному буфері, рН7 3, 2 -момент заміни розчину антитіл на буфер) Щ 3772К 8 3768Н P 3764Q С " 37603756Н k 3752 А 10 20 ЗО 40 50 60 0 70 10 20 ЗО 40 50 60 70 Час, хв. Час, хв. Фіг 2 Фіг. 1 42601 10 20 ЗО 40 50 60 70 80 90 100110120 Час, хв. Фіг-З. ДЖЕРЕЛА ІНФОРМАЦІЇ L Lofas S , Tegendal К, Rohnberg L Colloids and Surfaces В —1993 — I, — P 83-89 2 Mirsky V , Riepl M , Wolfleis О Biosens & BioeL — 1997 — 12, — №9-10 — P 977-989 3 Snopok В A , Kostyukevych К V , Rengevych О V et al Semiconductor Physics, Quantum Electronics & Optoelectronics —1999 — I , №1 — P 121-134 7 48537 8 4 Catimel T , Domagala T .Nerrie M et al use in biosensor systems, February 20, 1996, GO IN Protein and Peptide Letters — 1999 6,-P 319-340 33/543, G01N 33/551, G01N 33/553 5 Schuck P Annu Rev Biophys Biomol 9 Frattah V , Sterner R //Biochemistry -1968 Struct —1997 — 26, — P 541-566 7,-2 -P 521-530 6 Rich R L, Myszka DG Gurr Opinion Biotechnol —2000 — 11,—P 54-61 7 EP 0341 927, John Ch Boydell et al , Biological sensors, December 15 1989, G01N 21/75, G01N 21/43 8 U S Patent 5,492,840, Magnus Malmqvist et al Surface plasmon resonance sensor unit and its W Appukuttan P S , Chacko В P , Geetha M II Indian J Biochem Biophys 2000 - 37, №2 - P 77-80 II Tsang VC, Greene RM, Pilcher JB II J Immunoassay —1995 — 16, — P 395-418 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71