Спосіб оцінки активності синтетази оксиду азоту

Спосіб оцінки активності синтетази оксиду азоту, що включає одержання біологічного матеріалу, що містить клітини, які є джерелом синтетази оксиду азоту, фіксацію біологічного матеріалу в 4% розчині параформальдегіду, інкубацію в розчині, що містить нітросиній тетразолій і нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат-відновлений, та визначення КІЛЬКОСТІ формазану, який відрізняється тим, що як біологічний матеріал використовують суспензію відмитих тромбоцитів у концентрації 2 х 1 0 5 на 1 мкл, активність синтетази оксиду азоту визначають по КІЛЬКОСТІ формазану на 10 тромбоцитів Винахід стосується медицини, а саме лабораторної діагностики і може бути використаний для оцінки активності синтетази оксиду азоту у хворих із захворюваннями внутрішніх органів Оксид азоту є основною вазодилатуючою речовиною в організмі, а також відіграє важливу роль у процесах імунітету та функціонуванні нервової системи Про процеси синтезу оксиду азоту в організмі, можна судити по активності синтетази оксиду азоту Реєстрація активності синтетази оксиду азоту біологічних об'єктів та подальший аналіз отриманих даних, дозволяють використовувати їх як об'єктивні критерії синтезу оксиду азоту в організмі На фоні стабільності показників активності синтетази оксиду азоту в нормі, зрушення, обумовлені дією тих чи інших фізіологічних або патологічних агентів, легко виявляються та фіксуються Аналіз цих даних дозволяє адекватно відобразити процеси, що протікають у біологічній системі, що вказує на необхідність здійснювати оцінку активності синтетази оксиду азоту як у нормі, так при різних патологічних станах 3 Виготовляють мікропрепарати артеріальних судин стандартним способом 4 Инкубують отримані мікропрепарати в буферному розчині, що містить 0,3% Тритону Х-100, 0,1мг/мл нітросинього тетразолія, 1мг/л нікотинамід-аденш-динуклеотид-фосфату-відновленого протягом 1 години в темноті 5 Зупиняють реакцію, додаючи 70% етанол 6 Активність синтетази оксиду азоту, оцінюють по ступеню зміни забарвлення ендотеліальних клітин (Рорра V , Miyashiro J К, Marshall A et al Endothehal NO synthase is increased in regenerating endothehum after denuding injury of the rat aorta // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 1998 -Vol 18 -P 1312-1321 ) Суттєвими ознаками аналогу і винаходу, що збігаються, є такі 1 Одержання біологічного матеріалу, що містить клітини, які є джерелом синтетази оксиду азоту 2 Фіксація біологічного матеріалу у 4% розчині парафольмадегиду 3 Інкубація в розчині, що містить нітросиній тетразолій і нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат-відновлений Однак, при використанні цього способу визначення активності синтетази оксиду азоту, одержання біологічного матеріалу, що містить ендотеліальні клітини можливо тільки з трупного або Відомий спосіб оцінки активності синтетази оксиду азоту, що полягає в наступному 1 Отримують артеріальні судини, що містять ендотеліальні клітини, які є джерелом синтетази оксиду азоту, безпосередньо після убою лабораторних тварин 2 Фіксують артеріальні судини у 4% розчині параформальдегіду протягом 1 години 1 ю 00 00 48857 бюпсійного матеріалу Отримання матеріалу вказаним способом і наступні процедури пов'язані з підготовкою зразків для дослідження, можуть негативно вплинути на показники активності синтетази оксиду азоту Процедура одержання біологічного матеріалу, що містить клітини ендотелію вказаним способом робить його мало придатним для використання у КЛІНІЧНИХ дослідженнях через особливості отримання матеріалу та й тому що не дозволяє простежити динаміку зміни активності синтетази оксиду азоту у хворих при різних патологічних станах До того ж оцінка активності синтетази оксиду азоту проводитися напівкількісним способом Цей спосіб хоч і дозволяє принципово ОЦІНІТЬ активність синтетази оксиду азоту, однак точність і достовірність отриманих даних буде досить низькою Найбільш близьким за технічною сутністю та досягаємим результатом є спосіб оцінки активності синтетази оксиду азоту, що полягає в наступному 1 Одержують артеріальні судини, що містять ендотеліальні клітини, які є джерелом синтетази оксиду азоту, безпосередньо після убою лабораторних тварин 2 Виготовляють мікропрепарати артеріальних судин стандартним способом, використовуючи крютом 3 Фіксують отримані мікропрепарати у 4% розчині параформальдегіду протягом ЗО хвилин 4 Інкубують отримані мікропрепарати в буферному розчині, що містить 0,2% Тритону Х-100 протягом ЗО хвилин 5 Инкубуют мікропрепарати в розчині, що містить 0,2ммоль/л нітросинього тетразолія, 1ммоль/л нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфату-відновленого протягом 20 хвилин 6 Поміщають мікропрепарат на предметний столик мікроскопу, обладнаного відеокамерою 7 Захоплюють зображення мікропрепарату за допомогою відеограберу 8 Визначають КІЛЬКІСТЬ формазану за допомогою комп'ютерної системи аналізу зображення в умовних одиницях на одну клітину 9 Оцінку активності синтетази оксиду азоту визначають по КІЛЬКОСТІ гранул формазана на ендотеліальну клітину (Channon К М , Qian H , Nephoueva V et al In Vivo Gene Transfer of Nitric Oxide Synthase Enhances Vasomotor Function in Carotid Arteries From Normal and Cholesterol-Fed Rabbits // Circulation 1998 -Vol 98 -P 1905-1911 ) Спільними суттєвими ознаками прототипу і способу, що заявляється є 1 Одержання біологічного матеріалу, що містить клітки, які є джерелом синтетази оксиду азоту 2 Фіксація біологічного матеріалу в 4% розчині параформальдегіду 3 Інкубація в розчині, що містить нітросиній тетразолій і нікотинамід-аденін-динуклеотидфосфат-відновлений 4 Визначення КІЛЬКОСТІ формазана Незважаючи на те, що таким способом можливо визначати активність синтетази оксиду азоту, однак одержання біологічного матеріалу, якій є джерелом синтетази оксиду азоту незручний, не тільки тому, що нарушає ЦІЛІСНІСТЬ організму, та й тім, що отримання таким способом біологічного матеріалу, може привести до зміни показників активності синтетази оксиду азоту, що негативно відобразіться на точності і достовірності отриманих даних Крім цього оцінка КІЛЬКОСТІ формазана проводитися напівкількісним методом і отримані данні представлені в умовних одиницях Аналіз отриманих результатів дає лише приблизні дані про активність синтетази оксиду азоту Застосування мікроскопа з комп'ютерною системою аналізу зображення хоч і дозволяє точно оцінювати ступінь забарвлення мікропрепарату, але в досліджувану частину мікропрепарату можуть потрапити не тільки ендотеліальні клітини, що містять гранули формазана, але і м'язові клітини, що може вносити неточність в результат аналізу Вказані вище причини в підсумку значною мірою погіршують точність, достовірність, а особливо відтворюваність результатів дослідження В основу винаходу поставлена задача удосконалення способу оцінки активності синтетази оксиду азоту шляхом використання іншого біологічного матеріалу для дослідження зміни методики визначення КІЛЬКОСТІ формазана, що забезпечить підвищення достовірності, точності і відтворюваності результатів дослідження Поставлена задача вирішується тім, що в способі оцінки активності синтетази оксиду азоту, що полягає в одержанні біологічного матеріалу, що містить клітини, які є джерелом синтетази оксиду азоту, фіксації біологічного матеріалу в 4% розчині параформальдегіду, інкубації в розчині, що містить нітросиній тетразолій і нікотинамід-аденшдинуклеотид-фосфат-відновлений, та визначення КІЛЬКОСТІ формазана, новим є те, що як біологічний матеріал використовують суспензію відмитих тромбоцитів у концентрації 2 105 на 1мкл, активність синтетази оксиду азоту визначають по КІЛЬКОСТІ формазана на 10 тромбоцитів Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному у пропонованому способі як біологічний матеріал використовували тромбоцити, що так як і ендотеліальні клітини мають синтетазу оксиду азоту, аналогічну за біохімічними та антигенними властивостями, що робить їх зручним об'єктом для аналізу стану синтезу оксиду азоту в організму Використання тромбоцитів для аналізу активності синтезу оксиду азоту дозволяє уникнути ряду труднощів, що виникали при використанні ендотеліальних клітин Застосування тромбоцитів замість клітин ендотелія дозволяє проводити оцінку стану активності синтетази оксиду азоту в живому організмі, і що важливо, без порушення його ЦІЛІСНОСТІ Процес виділення і підготовки тромбоцитів для аналізу дозволяє виключити ряд процедур, що можуть вплинути на показники активності синтетази оксиду азоту, але є необхідні для одержання і підготовки біологічного матеріалу, що містить ендотеліальні клітини Зважаючи на вищевказане, тромбоцити як біологічний матеріал більш підходить для аналізу активності синтетази оксиду азоту через те, що показники активності синтетази оксиду азоту будуть більш достовірними і більш 48857 точно відображатимуть процеси, що відбуваються в організмі Використання тромбоцитів дозволяє застосувати пропонований спосіб оцінки активності синтетази оксиду азоту в КЛІНІЧНИХ умовах, тому що він дозволяє проводити оцінку активність синтетази оксиду азоту у при проведені функціональних проб та лікуванні, як у нормі, так і при виникненні патологічних процесів Оцінка активності синтетази оксиду азоту здійснюється шляхом визначення КІЛЬКОСТІ формазана на 107 тромбоцитов, що дозволяє перейти з напівкількісного визначення і відображення активності ферменту в умовних одиницях, до точного КІЛЬКІСНОГО визначення В цілому запропонований спосіб визначення синтетази оксиду азоту дозволяє значно підвищити точність, достовірності та відтворюваність результатів дослідження активності синтетази оксиду азоту Спосіб здійснюють таким чином 1 Виділення тромбоцитів роблять стандартним способом, прийнятим при дослідженні процесів гемостазу 2 Відмивання тромбоцитів роблять загальновідомим способом 3 Кінцеву концентрацію тромбоцитів у суспензії доводять до 2 105 у 1 мкл 4 Суспензію тромбоцитів змішують з холодним (4°С) 4% розчином параформальдепда 5 Отриману суміш шкубують 10 - 15хв при температурі 4°С 5 Після інкубації суспензію тромбоцитів змішують с розчином нітросинього тетразолія на Трис-НСІ буфері (рН 7,6), що містить хлорид калію, хлорид кальцію, хлорид магнію, нікотинамідаденш-динуклеотид-фосфат-відновлений 6 Інкубують ЗО хвилин при 37°С 7 Визначення КІЛЬКОСТІ формазану здійснюють стандартним способом 8 Оцінку активності синтетази оксиду азоту проводять по КІЛЬКОСТІ формазана в нг на 10 тромбоцитів Приклад Хворій С 43 років надійшов у кардіологічне відділення Запорізької обласної клінічної лікарні з скаргами на запаморочення, головний біль, "МІЛЬТІШИННЯ цяток" перед очима, дзвін у вухах, задишку при фізичному навантаженні Вважає собі хворим протягом 8 років, коли вперше, без видимої заподій, було зареєстровано носову кровотечу, яка супроводжувалася підвищенням артеріального тиску до 190 та 120мм рт ст Згодом хворий неодноразово знаходився на стаціонарному лікуванні з приводу гіпертонічної хвороби, одержував амбулаторну терапію р-блокаторами і діуретинами За тиждень до надходження в клініку, після сильного психоемоційного потрясіння, з'явилися вищезазначені скарги на тлі високих цифр артеріального тиску (до 180 і 110мм рт ст), і хворий був госпіталізований для купіровання гіпертонічного кризу та корекції проводимої терапії Анамнез життя - без особливостей, мати хворого страждала гіпертонічною хворобою, іншої спадкової патології в родині не виявлено Пацієнт палити протягом 13 років, ІНШІ ШКІДЛИВІ звички заперечує, алергологічний анамнез не обтяжений Об'єктивно спостерігаються наступні зміни Артеріальний тиск у момент надходження 180 і 100мм рт ст на ЛІВІЙ І 185 і 110мм рт ст на правій плечових артеріях, пульс 84 ударів у хвилину, задовільних властивостей При пальпації верхівний поштовх визначається на 2 - 2, 5 див зовні від середньоключичної лінії з лівої сторони в 6 міжребірьі, поширений, збільшений по висоті, посилений Перкуторно - розширення границь відносної серцевої тупості, аускультативно - ДІЯЛЬНІСТЬ серця правильна, посилений І тон на верхівці серця, у легенях дихання везикулярне, жорсткувате, у нижніх відділах з обох боків одиничні вологі дрібнобулькасті неконсонуючі хрипи Частота дихання 20 у 1 хвилину, дихання поверхневе На електрокардіограмі - ознаки гіпертрофії міокарда лівого шлуночка, порушення процесів реполярізацм в лівих грудних відведеннях При ехокардюграфічному дослідженні спостерігається збільшення кінцеводіастолічного і кінцеВОСІСТОЛІЧНОГО об'ємів лівого шлуночка, помірне зниження його скорочувальних властивостей, потовщення задньої стінки лівого шлуночка та міжшлуночкової перетинки, наявна гіпертрофія міокарда лівого шлуночка (індекс маси міокарда лівого шлуночка 123г/м3) При ренгенологичному дослідженні в легенях посилений судинний малюнок, корені структурні, тяжисті, більше з правої сторони При дослідженні очного дна визначається звуження і склерозування артерій, вени повнокровні, поширені, феномен Салюса-Гуна 11-І 1 ступеня 1 Дані інших інструментальних та лабораторних досліджень без особливостей Враховуючи скарги хворого, клінічну картину захворювання, дані об'єктивного дослідження і зважаючи на результати додаткових способів дослідження, хворому був поставлений КЛІНІЧНИЙ діагноз - Гіпертонічна хвороба, II стадія Враховуючи тяжкість захворювання, необхідність диференціальної діагностики з вторинними формами симптоматичних артеріальних ппертензій, а також враховуючи часту асоціацію порушення функції сінтетази оксиду азоту з підвищенням артеріального тиску, у хворого було проведено оцінку активності синтетази оксиду азоту загальновідомим способом 3 цією метою хворомубула проведена під шкірно-жирова біопсія для одержання артеріальних судин у ВІДПОВІДНОСТІ з загальноприйнятим методом Отримували артеріальні судини, що містять ендотеліальні клітини, які є джерелом синтетази оксиду азоту, безпосередньо після убою лабораторних тварин Фіксували артеріальні судини у 4% розчині параформальдегіду протягом 1 години Виготовляли мікропрепарати артеріальних судин стандартним способом Інкубували отримані мікропрепарати в буферному розчині, що містить 0,3% Тритона X100, 0,1мг/мл нітросинього тетразолія, 1мг/л нікотинамід-аденін-динуклеотид-фосфатувідновленого протягом 1 години в темноті Активність синтетази оксиду азоту, оцінювали за ступенем зміни забарвлення ендотеліальних клітин Результати оцінки синтетази оксиду азоту показали, що отримані дані відповідають практично здоровим особам, що скоріше пояснюється дією інших ферментів здатних відновлювати нитросиний тетразолий Тому у хворого була проведена оцінка активності синтетази оксиду азоту у ВІДПОВІДНОСТІ З запропонованим способом Виділення тромбоцитів робили стандартним способом, прийнятим при дослідженні процесів гемостазу Відмивання тром 48857 боцитів робили загальноприйнятим способом Кінцеву концентрацію тромбоцитів у суспензії доводили до 2 10 у 1мкл Суспензію тромбоцитів змішували з холодним (4°С) 4% розчином параформальдегіде Отриману суміш шкубували 10 - 15хв при температурі 4°С Після інкубації суспензію тромбоцитів змішували с розчином нітросинього тетразолія на Трис-НСІ буфері (рН 7,6), що містить хлорид калію, хлорид кальцію, хлорид магнію, шкотинамід-аденш-динуклеотид-фосфатвідновлений Інкубували ЗО хвилин при 37°С Визначення КІЛЬКОСТІ формазану здійснювали стандартним способом Оцінку активності синтетази оксиду азоту визначають за КІЛЬКІСТЮ формазана в нг на 107 тромбоцитів Отриманні результати оцінки синтетази оксиду азоту склали 270,12 ± 10,45нг формазана на 2 10 тромбоцитів Через 12 тижнів 8 комплексного лікування, яку включало додаткове застосування лікарських засобів, що зменшують ендотеліальну дисфункцію, при контрольному обстеженні поряд з поліпшенням клінічної картини захворювання та позитивною динамікою даних інструментальних досліджень, спостерігалося достовірне збільшення активності синтетази оксиду азоту яку на кінець курсу терапії склало 305,23 ± 11,68нг формазана на 210 тромбоцитів Таким чином, використання способу, що пропонується, дозволило вчасно визначити низький рівень активності синтетази оксиду азоту, та призначити патогенетично зумовлену терапію, що в підсумку призвело до підвищення якості діагностики, дозволило оптимізувати лікування і відвернути появу ускладнень ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71