Спосіб підтримки протеїногенності та однорідності виробничих культур атипових мікобактерій для виробництва антигену з атипових мікобактерій (аам)

Спосіб підтримки протеїногенності та однорідності виробничих культур атипових мікобактерій для виробництва антигену з атипових мікобактерій (ААМ), що включає одержання моноклонів виробничих штамів методом "виснажуючого" посіву та перевірку їх протеїногенності з подальшим відбором типових, протеїногенних клонів, який відрізняється тим, що ефекту "виснажуючого" посіву досягають шляхом розведення культур мікобактерій до концентрації 10-5 - 10-6 та опроміненням їх гама-променями у дозах 100 - 300 тис. Р з потужністю дози – 400 Р/год. (19) (21) 2001128240 (22) 03.12.2001 (24) 15.02.2006 (46) 15.02.2006, Бюл. № 2, 2006 р. (72) Кассіч Володимир Юрійович, Кассіч Юрій Якович, Завгородній Андрій Іванович (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ (56) Стейниер Р. и др. Мир микробов // М.- "Мир", 1979, Т.1.- с.37-40. RU 2139089 C1, 10.10.1999 UA 31081 A, 15.12.2000 3 49407 4 ням популяцій окремих клітин (моноклонів) [Стейничих культур атипових мікобактерій з викориснер Р. Дцельберг Е., Ингрем Дж. /Світ мікробів. танням методів одержання їх моноклонів та подаТ.1,1979,М. -"Мир”. - с.41]. льшим визначенням культуральних властивостей, Існують способи одержання чистих бактерійпротеїногенності та відбором найтиповіших клонів. них культур (тобто клонів) методом посіву на чашПри реалізації способу підтримки й перевірки ки штрихом і методом розведень [Стейнер P., протеіногенних властивостей та однорідності куЕдельберг Е., Ингрем Дж. /Світ мікрольтур атипових мікобактерій для виробництва анбів.Т.1,1979,М.-"Мир”. - с.37-40]. тигену з атипових мікобактерій (ААМ) поставлена Посів на чашки штрихом робиться таким чимета досягається одержанням моноклонів виробном. Стерилізовану зігнуту проволоку занурюють в ничих штамів мікроорганізмів з використанням розведену завись мікроорганізмів і потім проворізних методів. Клонування виробничих штамів дять нею ряд паралельних роздільних штрихів, що атипових мікобактерій досягається способом вине доторкаються одне до одного, по поверхні заснажуючих посівів, який здійснюється методами стиглого слою агару в чашці Петрі. При кожному послідовних розведень та (або) впливом пригнічунаступному штриху здійснюється поступове розючих ріст мікобактерій доз гамма-випромінення. З ведення інокуляту, так що навіть якщо перші одержаних моноклонів відбирають типові за хараштрихи дадуть суцільний ріст, впродовж наступних ктером росту колонії в S-формі, з них, згідно схеми штрихів будуть рости окремі колонії. Недоліком технологічного процесу, готують моноалергени, в методу є те, що одержані таким чином колонії мояких визначають кількість білку по К'єльдалю та жуть бути не чистими клонами. відбирають найпротеїногенніші. Таким чином доОдержання чистих культур мікроорганізмів в сягається контроль однорідності і підтримка протерідких середовищах здійснюється методом розвеіногенності виробничих культур. день. Інокулят послідовно розводять стерильним Приклад 1. Посів виробничих штамів на щільрідким середовищем і аліквотами з кожного розне живильне середовище для культивування міковедення засівають велику кількість пробірок з себактерій (ТУУ 46.15.063-95) здійснювали штрихом редовищем. Мета цієї операції -інокулювати ряд за модифікованою нами методикою. Стерилізовапробірок настільки розведеною суспензією мікрооний фломбуванням бактеріологічний шпатель внорганізмів, щоб вірогідність внесення в певну пробісили в бактеріальну масу кожного виробничого рку навіть однієї мікробної клітини була досить штаму мікобактерій, після чого зигзагообразно малою (порядку 0,05). Якщо таким розведеним проводили їм по поверхні елективного щильного інокулятом засівається багато пробірок, то по теоживильного середовища в бактеріологічній пробірії вірогідності можна вилічити, що в 95 % усіх зарці. Результати дослідження термінів та характеру сіяних пробірок не попадає ні однієї мікробної кліросту і культу ральних властивостей одержаних тини. По одній особі попадає в 4,8 % пробірок, по культур наведені в таблиці. З матеріалів таблиці дві - в 0,12% пробірок, а в 0,002 усіх засіяних провидно, що при посіві штрихом окремих колоній бірок попаде по три особі. Тому, якщо в пробірці (моноклонів) виробничих культур не було одержапомітно ріст, то скоріше за все цей ріст обумовлено. но попаданням в неї всього одного мікроорганізму. Приклад 2. Посів виробничих штамів методом Вірогідність цього становить послідовних розведень на щільне живильне середовище для культивування мікобактерій здійснювали за модифікованою нами методикою з розведень 10-4-10-6мг бактерійної маси в 1см3 Вірогідність того, що ріст викликано попаданфізрозчину. Розведення мікобактерій виробничих ням в пробірку лише одного організму, знижується штамів робили таким чином. Стерильним бактеріз підвищенням середнього числа клітин в інокуляологічним шпателем знімали з живильного сереті. Тому важливо, щоб виділення проводилось з довища бактеріальну масу кожної виробничої кутієї серії пробірок, де в переважній більшості вильтури атипових мікобактерій і вміщували її у падків не відзначають росту. Метод дуже об'ємокремий стерильний флакон з бусами, попередньо ний, трудоемкий, потребує багато стерильного зважений на аналітичних вагах. Флакони з бактелабораторного посуду та елективних середовищ. ріальною масою знову зважували на аналітичних Його можна використовувати лише для виділення вагах. Різниця між вагою флакона з культурою і чистих культур в змішаній популяції мікроорганізпорожнього є вагою наважки бактеріальної маси. мів. Наважку бактеріальної маси гомогенізували у За результатами наших досліджень ефекту флаконі з бусами в стерильному фізрозчині (pH "виснажуючого" посіву можна досягти також шля7,0±0,2) з розрахунку 1см3 фізрозчину на 1мг бакхом опромінення культур мікобактерій гаммамаси. По 1см3 одержаної зависі кожного виробнивипроміненням в діапазоні доз: 100тис.-600тис.Р чого штаму переносили в пробірки, в які поперед("пригнічуючі" та "стерілізуючі" дози). При цьому ньо вливали по 9см3 стерильного ізотонічного настає репродуктивна загибель частини мікробних розчину хлориду натрію. Таким чином було одер-1 3 клітин і після висіву опромінених культур на елекжано розведення 10 . По 1см цього розведення тивні живильні середовища відзначають ріст поокожної виробничої культури переносили в другу диноких колоній, які розвиваються з окремих мікпробірку з 9см3 фізрозчину, з другої пробірки 1см3 робних клітин. суміші переносили в третю, з третьої - в четверту В основу винаходу, що передбачається, посз 9см3 фізіологічного розчину, в якій одержували тавлено завдання розробити спосіб підтримки й розведення 10-4. З четвертого розведення кожної перевірки протеіногенності та однорідності виробвиробничої культури по 1см3 зависі переносили в 5 49407 6 п'яту пробірку з 9мл фізрозчину, з п'ятої 1мл рідинення бактеріальну масу кожної виробничої кульни вносили в шосту пробірку, одержуючи таким тури атипових мікобактерій і вносили в окремий чином розведення 10-5 та 10-6 . При виготовленні стерильний флакон з бусами, попередньо зважекожного наступного розведення використовували ний на аналітичних терезах. Флакони з бактеріаокрему стерильну піпетку, а мікробні суміші ретельною масою знову зважували на аналітичних льно змішували. терезах. Різниця між вагою флакона з культурою і Завись бактеріальної маси виробничих штамів порожнього є вагою наважки бактеріальної маси. з розведень 10-5-10-6 висівали на поверхню щільНаважку бактеріальної маси гомогенізували у ного живильного середовища для культивування флаконі з бусами в стерильному фізрозчині (pH мікобактерій в 10 пробірок по 0,1см3 в кожну. Про7,0±0,2) з розрахунку 1см3 фізрозчину на 1мг бакбірки поміщали в термостат в нахиленому поломаси. женні на 24 години. Через 24 години пробки пробіЗавись бактеріальної маси виробничих штамів рок заливали парафіном. Посіви в з розведення 1мг/см3 висівали на поверхню щільбактеріологічних штативах інкубували в термостаті ного живильного середовища для культивування при +37°С протягом 4 тижнів. Проглядали посіви мікобактерій в 10 пробірок по 1,0см3 в кожну. Прочерез 3-5 діб. Матеріали дослідження термінів та бірки поміщали в термостат в нахиленому полохарактеру росту і культуральних властивостей женні на 24 години. Через 24 години пробки пробіодержаних культур-клонів наведені в таблиці. Рерок з посівами парафінували над вогнем зультати досліджень свідчать про те, що при висіві спиртівки. Посіви інкубували в термостаті при з розведень 10-5-10-6 виробничі культури атипових +37°С протягом 4 тижнів. Проглядали посіви через мікобактерій ростуть поодинокими колоніями3-5 діб. Матеріали дослідження термінів та харакмоноклонами. Кожна така колонія розвивається з теру росту і культуральних властивостей одержаоднієї мікробної клітини і являє собою клон мікобаних культур-клонів наведені в таблиці. Результати ктерій. Дослідженнями різних клонів доведено, що досліджень свідчать про те, що при висіві виробїх культуральні властивості та протеїногенність не ничих культур атипових мікобактерій, опромінених відрізняються від аналогічних показників вихідних в дозах 100-300тис.P відзначали ріст поодинокими виробничих штамів (вихід білку не нижче ніж у виколоніями-моноклонами. Кожна така колонія розхідних культур), що свідчить про однорідність та вивається з однієї мікробної клітини і являє собою протеїногенність культур. клон мікобактерій. Після опромінення дозою Приклад 3. Висіви виробничих штамів атипо600тис.Р росту мікобактерій на живильних середових мікобактерій на щільне живильне середовище вищах не відзначали (репродуктивна загибель методом виснажуючого посіву з використанням мікобактерій). Дослідженнями різних клонів виробрадіаційної техніки здійснювали з розведення 1мг ничих штамів доведено, що їх протеїногенність та бактеріальної маси в 1см3 стерильного фізрозчину культуральні властивості не відрізняється від анапісля попередньої обробки посівного матеріалу логічних показників у вихідних виробничих культур, пригнічуючими дозами гамма-променів. Для цього що свідчить про однорідність та повноцінність кубактеріальну масу виробничих культур атипових льтур. мікобактерій, вирощену на середовищі Сотона та Таким чином, використанням передбачених (або) на середовищі для культивування мікобактеспособом підтримки й перевірки протеіногенних рій (ТУУ 46.15.063-95) з додаванням ростових фавластивостей та однорідності культур атипових кторів бактеріологічною петлею вносили в стеримікобактерій для виробництва антигену з атипових льні бактеріологічні пробірки, закривали гумовими мікобактерій (ААМ) досліджень досягається мета пробками, які закріпляли пластиром. Пробірки з одержання моноклонів виробничих культур атипобакмасою розміщали в металевому контейнері і в вих мікобактерій. Культуральні, біохімічні та протетакому стані піддавали опроміненню на гаммаїногенні дослідження моноклонів дають можливипромінювачі "Исследователь" (джерело випровість контролювати однорідність, перевіряти та мінювання 90Со, потужність дози: Р=400Р/год.) в підтримувати культуральні властивості та протеїдозах 100000, 300000 та 600000Р. Після опроміногенність виробничих культур. 7 Комп’ютерна верстка М. Клюкін 49407 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601