Спосіб культивування збудників туберкульозу та атипових мікобактерій

Спосіб культивування збудників туберкульозу і атипових мікобактерій на синтетичному живильному середовищі, який відрізняється тим, що для адаптації туберкуліногенних штамів до синтетичних живильних середовищ проводять їх попереднє культивування на середовищі, що містить Картопляний відвар 100-150 см 3 Гліцерин хімічно чистий 1,0-5,0 см 3 при рН - 7,0 Передбачаємий винахід відноситься до ветеринарної мікробіології для адаптації туберкупіногенних штамів культур мікобактерій до росту на синтетичному живильному середовищі і може бути використаним в ветеринарній медицині та біологічній промисловості для вирощування збуДників туберкульозу і атипових мікобактерій з метою прискореного накопичення бактерійної маси та виготовлення препарату для алергічної діагностики туберкульозу у сільськогосподарських тварин. Є живильне середовище для вирощування мікобактерій туберкульозу, що містить калій фосфорнокислий • однозаміщений, натрій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, залізо лимоннокисле аміачне, Ласпарагін, гліцерин, твін-80, сироваточний бичачий альбумін, ДЛ-метюнін, натрій лимоннокислий (А. с. № 1473343, C12N1/20, 1986 г ) Існує спосіб вирощування на синтетичному живильному середовищі збудника туберкульозу бичачого виду, що містить ферментолізат дріжджів, лізат галатобактерій, амоній лимоннокислий, калій фосфорнокислий двозаміщений, лимонну кислоту, магній сірчанокислий, залізо сірчанокисле, цинк сірчанокислий, гліцерин (А. с. № 1659472, C12N1/20, 1991 г.) Найбільш близьким за технічною суттю до заявляемого об'єкту є синтетичне живильне середовище Сотона, яке використовують у біологічній промисловості для вирощування збудника туберкульозу бичачого виду. Недоліком цього середовища є те, що після 5-6 послідовних пассажів виробничий штам дов го накопичує бактерійну масу, а також втрачає морфологічні, біологічні та туберкуліногенні властивості. Для підтримки цих властивостей такі культури пасажують через організм великої рогатої худоби Виділені від цих тварин культури погано ростуть на синтетичних середовищах і мало виділяють протеїну Відновлення цих властивостей у мікобактерій потребує багаторазових пасажів з метою їх пристосування до синтетичних середовищ, на що витрачається багато часу і коштів. Аналогів пропонованому винаходу у доступній літературі немає. В основу винаходу поставлене завдання пошук способу адаптації туберкуліногенних штамів до синтетичного живильного середовища, яке використовують у біологічній промисловості з метою виробництва туберкуліну для ссавців, та комплексного алергену із атипових мікобактерій. Ця задача вирішується шляхом попереднього висіву туберкуліногенних штамів та епізоотичних культур мікобактерій на середовище, що містить відвар з 4% гліцерину. При появі росту цих культур на поверхні середовища у вигляді плівки, їх пересівають на синтетичне живильне середовище Сотона. Це забезпечує більш інтенсивний ріст і накопичення бактерійної маси мікобактерій. Спосіб виконується при слідуючому співвідношенні компонентів: Картопляний відвар 100-150 см 3 Гліцерин хімічно чистий 1,0-5,0 см 3 при рН - 7,0 Аналіз відомих синтетичних живильних середовищ для вирощування туберкуліногенних о со ю со < 34560 штамів і епиоотичних культур мікобактерій показав що при посів» на ці середовища збудників туберкульозу і атипових мікобактерій не у всіх випадках виростають культури мікобактерій у першій адаптивній генераци Проте використання способу адаптації туберкуліногенних культур мікобактерій шляхом попереднього їх висіву на картопляний відвар з 4% гліцерину і послідуючим їх пересівом на синтетичне живильне середовище Сотона дозволяє прискорити час та поліпшити пристосування культур мікобактерій і інтенсивність росту та накопичення бактерійної маси Порівняння заявляемого способу з прототипом свідчить про те що цей спосіб з адаптацією туберкуліногенних штамів мікобактерій відрізняється від відомого інтинсивністю росту культур та грискоренням часу накопичення бактерійної маси Для виконання цього способу беруть 500 грамів картоплі яку ретельно миють водопровідною водою, очищають від шкірки здрібнюють і протягом однієї години витримують у 1% розчині бікарбоната натрія Потім цей розчин зливають а шматочки картоплі промокають фільтрувальним папером і розміщують у колбу ємкістю 2000 см3,в яку заливають 1000 см 3 дистильованої води і ки п'ятять протягом 30 хвилин Шматочки картоплі відкидають а картопляний відвар фільтрують через паперовий фільтр До фільтрату добав ляюгь ХІМІЧНО чистий гліцерин до 4% концентрації його у відварі ретельно перемішують і у флакони ємкістю 500 см 3 розливають по 100-150 см 3 , а потім стерилізують при температурі 120°С протягом 30 хвилин Стерильність картопляного відвару перевіряють шляхом витримування його у термостаті при 37°С протягом трьох діб У флакони з стерильним картопляним відваром бактеріологічною петлею роздільно ви-t стають культури збудників туберкульозу та атипові мікобактерії що виросли на щільному яєчному живильному середовищі для культивування мікобактерій Флакони з посівами закривають ватномарлевими пробками і розміщують в термостаті при температурі 37 5-38°С За посівами ведуть спостереження протягом 60 діб Приклад 1 Картопляний відвар готують, як вказано вище, при такому співвідношенні компонентів мас % Картопляний відвар - 100,0 Гліцерин ХІМІЧНО чистий - 1,0 рН - 7,0 Приклад 2 Теж, що і в прикладі N9 1 при слідуючому співвідношенні компонентів, мас % Картопляний відвар - 100,0 Гліцерин ХІМІЧНО чистий - 2,0 рН - 7,0 Приклад 3. Теж що і в прикладі № 1, при слідуючому співвідношенні компонентів мас % Картопляний відвар - 100,0 Гліцерин ХІМІЧНО чистий - 3,0 рН - 7,0 Приклад 4 Теж, що і в прикладі № 1, при слідуючому співвідношенні компонентів мас % Картопляний відвар - 100,0 Гліцерин ХІМІЧНО чистий - 4,0 рН-7,0 Приклад 5. Теж, що і в прикладі № 1, при слідуючому співвідношенні компонентів, мас % Картопляний відвар - 100,0 Гліцерин хімічно чистий - 5,0 рН-7,0 Показники інтенсивності росту культур мікобактерій на картопляному відварі з гліцерином приведені в таблиці 1 Таблиця 1 Інтенсивність росту культур на картопляному відварі Штам мікобактерій Інтенсивність росту культур в днях Приклад 1 Приклад 2 Приклад 3 Приклад 4 Приклад 5 М бовінус-8 ЗО ео 15 ЗО 60 15 ЗО 60 15 30 60 15 30 60 4 4 15 44 4 и 44 4 4 44 4 U 4 4 Ш Ц і U Ш М 6овю(еп»зоотична культура) 4 4 44 4 4 4 44 4 4 44 4 и 4 4 44 4 и 4 4 4 44 4 М авіум 44 4 44 4 4 44 4 и 4 4 и и 4 4 4 4 и 4 4 4 4 44 4 М скрефупяцеум 4 44 4 4 4 4 44 4 и 4 4 и и 44 4 4 4 и 4 4 44 4 41 М фортуїтум 4 4 4 4 U 44 4 U U 44 4 4 4 и 4 4 4 4 и 4 4 44 4 и 4 - поганий ріст 4 - задовільний ріст 4 44 - хороший ріст 4 U - відмітний ріст Вихід бактерійної маси в мг на середовищі Сотона після та без попереднього по сіву на картопляний відвар приведено в таблиці 2 34560 Таблиця 2 Вихід бактерійної маси на синтетичному живильному середовищ» Сотона в мг сухої речовини (СР) Штам мікобактерій Кількість бакмаси в мг(СР) на середовищі Сотона Після попереднього посіву на Без попереднього посіву на картопляний відвар картопляний відвар (контроль) М бовінус-8 242 225 М бовіс(епізоотична культура) 240 230 М авіум 393 340 М скрофуляцеум 567 420 М фортуїтум 689 678 З матеріалів таблиці 1 видно, що при ПОСІВІ культур мікобактерій на картопляний відвар з гліцерином, інтенсивність росту мікобактерій у вигляді плівки була кращою там, де містилось 4% гліцерина При лосів» культур мікобактерій із картопляного відвару де було 4% гліцерина, на синтетичне живильне середовище Сотона (табл 2) в першій генерації культури швидко пристосовувались до росту на цьому середовищі, виростали у вигляді плівки а накопичення бактерійної маси становило у шт бовінус 8 - 242 мг, шт Бовіс (епізоотична культура) - 240 шт М авіум - 393, шт М скрофуляцеум - 567 шт М фортуггум - 689 мг При ПОСІВІ цих культур на середовище Сотона без попередньої їх адаптації на картопляному відварі інтенсивність росту культур була значно меншою а накопичення бактерійної маси становило у шт М бовінус-8 - 225 мг шт М бовіс ~ 230 шт М авіум - 340, шт М скрофуляцеум ~ 420 шт М фортуїтум - 678 мг Результати проведених досліджень свідчать про те, що попередня адаптація культур мікобактерій сприяє росту культур у вигляді плівки та кращому пристосуванню до росту на синте* тичному середовищі Сотона Про це свідчать також дані таблиці 2 де показано, що накопичення бактерійної маси у культур мікобактерій бичачого виду було більше на 10-17 мг, пташиного - иа 53 і атипових мікобактерій - на 11-147 мг, в порівнянні з прототипом, де висів культур проводили без адаптації на картопляному відварі з гліцерином Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патенті» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03