Спосіб генетичної трансформації рослинних клітин

1. Спосіб генетичної трансформації рослинних клітин, за яким отримують трансформовану рослинну клітину шляхом введення до устячкової клітини рослини фрагмента ДНК, що містить селективний маркерний ген, який не має стійкості до антибіотиків, здійснюють подальше оброблення трансформованої рослинної клітини прийнятним селективним агентом та наступну регенерацію цілої рослини з трансформованої рослинної клітини, причому використовують устячкові клітини рослини, розташовані у епідермісі старіючої частини листа рослини. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що перед регенерацією здійснюють перетворення устячкової клітини рослини у протопласти. 3. Спосіб за пп. 1, 2, який відрізняється тим, що перетворення устячкової клітини рослини у протопласти здійснюють за допомогою ферментативного розщеплення стінки клітини рослини. U 2 (19) 1 3 трансформації шляхом прямого переносу гену з наступною регенерацією рослини. Таким чином, вибір способу трансформування клітин рослини, якими є цукровий буряк, є обмеженим тільки тими способами, які прийнятні для цільового типу рослини. Для однодольних рослин також відомо спосіб введення генних конструкцій, зокрема, у випадку однодольних рослин є так званий спосіб "біообстрілу", за яким металеві частки високої щільності (звичайно з вольфраму або золота), покриті генною конструкцією, вистрілюють у цільову клітинну культуру за рахунок вибухового виділення газу. Такий альтернативний підхід не володіє високоточною спрямованістю, характерної для мікроінжекції та мікропроколювання, але його переваги полягають у швидкому нанесенні, що дозволяє за короткий час "вдарити" по великій кількості клітин з утворенням у результаті великого числа ймовірних трансформантів, які можуть бути піддані добору. Недоліком способів такого типу є те, що їх проведення вимагає застосування дорогих металів, і, хоча в порівнянні з іншими випробуваними способами даний спосіб більше швидкий, проте, і він вимагає більших витрат часу. І все-таки при кожному бомбардуванні досягається велика кількість випадків трансформування. Також недоліком описаного способу є дія тиску газу, що розширюється, на цільову тканину. Інша проблема полягає у труднощах, пов'язаних із прицільним обстрілом зарядом вразливої області у мішені. Для подолання останньої проблеми сконструйовані різноманітні пристрої, що сприяють мікроприцілюванню, наприклад, такі, як описано у джерелі [Leduc та інші, Sex Plant Reprod, Volume 7 Number 1, стор. 135143 (1994)], але там не міститься відомостей про отримання трансгенних рослини цією технологією. Винахідникам невідомо публікацій, за якими здійснюють спосіб трансформації рослини шляхом прямого переносу гена з наступною регенерацією рослини. Завданням корисної моделі, що заявлено, є отримання способу трансформації рослинної клітини, зокрема для рослини цукрового буряку, шляхом прямого переносу гену з наступною регенерацією рослини з одночасним спрощенням способу трансформації та підвищення його частоти. Отримання такого способу можливе при наступних умовах. Ген, який вбудовується, повинен бути включений у фрагмент ДНК, що містить ефективні регуляторні елементи, призначені для ведення транскрипції гена. Крім того, необхідно забезпечити механізм переносу фрагмента ДНК у рослинну клітину. Після того, як фрагмент ДНК розташовано у клітинній мембрані, відбувається або не відбувається інтеграція її в ендогенний хромосомний матеріал. Ймовірність інтеграції може бути збільшена певними засобами. Тип клітини-мішені повинен бути таким, щоб клітини могли бути регенеровані в цілу рослину. Необхідно враховувати, що трансформування клітин рослин більш тяжке ніж трансформування бактеріальних клітини та клітини тварин, що обумовлюється наявністю твердих клітинних стінок, 49529 4 що створюють бар'єр для впровадження фрагмента ДНК через стінку рослинної клітини. Поставлене завдання вирішується таким чином, що забезпечують спосіб генетичної трансформації рослинних клітин, за яким отримують трансформовану рослинну клітину шляхом введення до устячкової клітини рослини фрагмента ДНК, що містить селективний маркерний ген, який не має стійкості до антибіотиків, здійснюють подальше оброблення трансформованої рослинної клітини прийнятним селективним агентом та наступну регенерацію цілої рослини з трансформованої рослинної клітини, причому використовують устячкові клітини рослини, розташовані у епідермісі старіючої частини листа рослини. Перед регенерацією можуть здійснювати перетворення устячкової клітини рослини у протопласти. Також перетворення устячкової клітини рослини у протопласти можуть здійснювати за допомогою ферментативного розщеплення стінки клітини рослини. Перетворення устячкової клітини рослини у протопласти можуть здійснювати до або після отримання трансформованої рослинної клітини. Перед регенерацією можуть отримувати суспензію рослинних клітин шляхом розмочування устячкових клітини рослини. Також можуть здійснювати перемішування суспензії рослинних клітин з мікроскопічним волокнистим матеріалом та введення спадкового матеріалу. Введення спадкового матеріалу можуть здійснювати шляхом прямої інсерції. Трансформовану рослинну клітину можуть отримувати у клітинній популяції рослини, яка містить замикаючі клітини. Можуть здійснювати регенерацію з отриманням калусної тканини у негормональному середовищі. Зазначений спосіб найкраще підходить до клітин рослини цукрового буряку. Між сукупністю суттєвих ознак та технічним результатом, що отримується, є наступний причинно-наслідковий зв'язок. Відомо, що у епідермальному шарі листів, стеблах та визначеній репродуктивної тканини, наприклад, пильовиках, зустрічається певний тип спеціалізованих клітин, відомих за назвою "замикаючих клітин". Крім того, у міру старіння листів замикаючі клітини мають тенденцію до більше пізнього відмирання, чим інші клітини. Таким чином, в'янучі листи є джерелом, особливо збагаченим життєздатними замикаючими клітинами. Замикаючі клітини регулюють отвору листьевых пор або устячок ["Stomatal Function", під редакцією Zeiger та інших, 1987 р.]. Також відомі способи виділення клітин устячок і їхнього перетворення в протопласти [Mawson B.T., Plant Cell Environment, 16, стор. 207-214 (1993)]. Замикаючі клітини являють собою невеликі клітини унікальної форми, стінки яких порівняно товще, твердіше та містять більше пектину в порівнянні з іншими клітинами листів. Канал устячка утворений двома замикаючими клітинами. Існують дві базові форми замикаючих клітин: еліптична форма і зла 5 кова форма. У цій заявці під визначенням «устячковий» та «устячко» розуміють не тільки пори, а також прилягаючі та замикаючі клітини листа рослини, які утворюють комплекс устячка. Під «замикаючою клітиною» розуміють зазначення кожної клітини, яка задіяна у створенні комплексу устячка. Винахідниками виявлено, що саме помітна пружність замикаючих клітин разом з несподіваною тотипотентністю клітин і їхні протопласти в порівнянні із клітинами інших типів робить замикаючі клітини особливо прийнятними для цілей соматичної гібридизації, утворення цитоплазматичного гібриду або трансформації. Проте, таку пружність можна розглядати і як потенціальний бар'єр для впровадження ДНК у клітину. З корисною моделлю, замикаючі клітини справді можуть бути трансформовані, трансформовані клітини можуть бути потім регенеровані, таким чином, здійснюється ефективний спосіб одержання трансгенних рослин. Одним з важливих аспектів даного способу є те, що він застосовний для трансформації рослин цукрового буряка, який відноситься до виду (Beta Vulgaris), тобто виду, який дотепер трансформували лише з неприйнятно низькою частотою, як було зазначено у джерелі [Lindsey та інші, Transformation in Sugar Beet (Beta Vulgaris L) у виданні Biotechnology in Agriculture and Forestry, 23, "Plant protoplasts and Genetic Engineering IV" VPS Bajaj, редакція СпрінгерФерлаг, Берлін, 1993]. В одному із можливих варіантів здійснення корисної моделі тканина листів або їх епідермальний шар розмочують і переробляють із утворенням культури, що має замикаючі клітини, стінки клітин розщеплюють з утворенням протопластів, протопласти трансформують найбільш прийнятним способом, трансформанти піддають добору та з трансформантів регенерують рослини. І ще в одному варіанті тканину листів розмочують і з неї одержують клітинну популяцію, збагачену замикаючими клітинами. Потім збагачену клітинну популяцію піддають трансформації та з трансформантів регенерують цілу рослину. Перед трансформацією замикаючі клітини можуть бути перетворені у протопласти. В іншій реалізації заявленого способу шматочки епідермісу можуть бути відділені вручну, після чого з них одержують калус. Заявлений спосіб може включати деякі з наступних стадій: трансформацію, виділення епідермію, виділення замикаючих клітин, одержання із замикаючих клітин протопластів, добір трансформантів і регенерація із трансформантів цілих рослин. Однак порядок, у якому ці стадії можуть бути здійснені, може мінятися, і певні стадії можуть бути пропущені, при цьому кожен варіант має свої переваги. Так,може бути трансформована інтактна тканина листа, після чого отриманий продукт або виділений з нього епідермій розмочують з одержанням клітинної суспензії, що при необхідності обробляють ультразвуком. Метою застосування цих процедур є переважне руйнування клітинних типів, відмінних від замикаючих клітин. Внаслідок порівняно більшої стійкості замикаючих клітин до таких фізичних навантажень концентрація цих клі 49529 6 тин підвищується, і вони можуть бути, потім виділені із суспензії флотацією або фільтруванням та регенеровані в ціла рослина. За описаним вище способом є фрагмент ДНК, що вбудовують, може включати маркерний ген, який піддається виявленню, найбільш звичайний маркерний ген стійкий до антибіотика, наприклад канаміцину або гігроміцину, або це ген зі стійкістю до гербіцидів, наприклад, таких як BASTA. Листи рослини потім можуть бути піддані впливу, необхідного для добору тиску, причому в суспензію переходять тільки клітини, що вижили, або, якщо до суспензії цільної тканини листа додається необхідний для добору агент, виділені життєздатні замикаючі клітини складаються тільки із трансформованих клітин, і в цьому випадку немає необхідності у окремій стадії добору. Найкраще, щоб фрагмент ДНК був повністю вільний від генів, які володіють стійкістю до антибіотика. Таким чином, рекомендується, щоб маркер, що піддається добору для рослинних клітин, був гербіцидним біолафосом. Добір на бактеріальній стадії одержання конструкції включає застосування Saccharo-myces cerevisiae IGPD гена (імідазол-гліцерин-фосфатдегідрогеназа), здатного функціонально доповнювати мутантні his В штами Е соlі з дефіцитом біосинтезу гістидину з відновленням росту цих штамів на мінімальному середовищі. Застосування такої ауксотрофної комплементарної системи для рекомбінантного добору виключає необхідність впровадження у плазміди, які оброблюються у Е соlі перед введенням у рослинні клітини, бактеріального маркера зі стійкістю до антибіотику, наприклад, бета-лактамази. Також може бути отримана суспензія замикаючих клітин, та суспендовані клітини можуть бути піддані трансформації. В цьому випадку застосовують звичайно спосіб вихровий обробки з волоконним матеріалом, наприклад, вусами з карбіду кремнію. Трансформація може бути здійснена до або після одержання концентрату замикаючих клітин. Вищенаведеними способами може бути приготовлено суспензії замикаючих клітин або збагачена суспензія, і перед трансформацією ферментативним розщепленням клітини можуть бути перетворені в протопласти И, нарешті, з протопластів можуть бути регенеровані рослини. Застосування протопластів як мішень для трансформації може дозволити застосувати певні відомі методики трансформації, які неефективні для інтактних замикаючих клітин. Найпростіший варіант здійснення корисної моделі включає трансформацію інтактного листа або виділеного епідермія, приготовленого механічними засобами або вручну, з наступної регенерацією під необхідним для добору тиском. Оскільки відомо, що ніякі інші клітинні типи, крім замикаючих клітин, не здатні до регенерації, ці клітини будуть просто проліферувати без регенерації, не заважаючи регенерації трансформованих замикаючих клітин. Особливо прийнятними можуть виявитися частково зів'ялі листи (переважно містять тільки життєздатні замикаючі клітини). Специфічний спосіб введення фрагмента ДНК не є суттєвим для цього 7 49529 способу, його вибір визначається тільки простотою застосування. Однак, винахідниками при одержанні трансгенних рослин досягнуто успіхи застосуванням відомої методики трансформації протопластів при участі поліетиленгліколю (ПЕГ) з наступним добором і регенерацією. Корисну модель проілюстровано прикладом її виконання. Зазначений приклад ніяким чином не обмежує можливих варіантів виконання заявленого способу, а тільки пояснює його здійснення. Культуру асептичних пагонів цукрового буряку одержують у такий спосіб. Семена стерилізують витримуванням протягом 50 хвилин в H2SO4. Після чого їх ретельно промивають водопровідної водою Потім насіння поміщають на 15 хвилин в демінералізовану воду при 55 С, після чого витримують 30 хвилин в 5%-вому розчині гіпохлориту натрію для стерилізації. Потім видаляють стерилізуючий розчин промиванням ще три рази (5, 10 та 15 хвилин) стерильною водопровідною водою. Пророщення відбувається на водному агарі (1,5% агару у водопровідній воді) при 22 С на світла. Стерильні сходи потім культивують 4 тижні на наступному середовищі, який готують так: у MS середовище половинної сили [Marashiga Т., Skoog F., (1962), Physiologia Plantarum, 15, стор. 473-479] додають 3% сахарози, 0,3% Гєлтайна (фірмова назва препарату) з рН 5,8 та здійснюють автоклавування. Культивування здійснюють перед вида Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 8 ленням меристем для субкультивування на тім же середовищі. Проростки субкультивують кожні три тижні та протягом цього часу видаляють і розташовують у свіжому середовищі. Усі культури інкубують на світлі (16 годин на день, 3000 люкс) при 22 С. Коли рослини досягають стадії в чотири листа (звичайно через 5-6 тижнів, а для однієї субкультури через три тижні), їх переносять в пробірки для культивування, що містять 15мл середовища, яке готують так: змішують 3% сахарози, 0,8% Агарози, 25мкМ індолмасляної кислоти (ІМК), додають PGo середовище [De Greef W., Jacobs M., (1919), Plant Science Letters, 17, стор. 55-61]. Культивування продовжують у вищенаведених умовах. Коли хоча б одне з корінь досягає довжини в 1см, рослини витягають із пробірок для культивування, промивають струменем водопровідний води з видаленням будь-яких фрагментів агару та висаджують у ґрунт у горщечках розміром 9см у теплицях. Для створення вологого середовища рослинки на сім днів покривають прозорої пластикової чашкою, після чого вони можуть вирощуватися без додаткового захисту. Заявлена корисна модель дозволяє отримати спосіб трансформації рослинної клітини, зокрема для рослини цукрового буряку, та спрощення способу трансформації та підвищення його частоти здійснення. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601