Спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу курей при скринінгу хімічних препаратів як дезінвазійних засобів

Спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу курей при скринінгу хімічних препаратів як дезінвазійних засобів, що включає накопичення біомаси, обробку тест-культур розчинами хімпрепаратів, центрифугування, проведення біопроби, який відрізняється тим, що здійснюють біопробу за допомогою формування 3-х груп: 1 - дослідна, яку заражають тест-культурою, 2 контрольна, якій ентерально задають вірулентні збудники без хімічної обробки, 3 - контрольна група - стерильна. (19) (21) u200912683 (22) 07.12.2009 (24) 25.06.2010 (46) 25.06.2010, Бюл.№ 12, 2010 р. (72) СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, ПРИХОДЬКО ЮРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, МАРШАЛКІНА ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА, ЗАІКІНА ГАННА ВАЛЕРІЇВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 цього беруть 1-2мл суміші декількох видів эймерій, осаджують в пробірці центрифугуванням, додають дослідний препарат в об'ємі 3-5мл, перемішують і виливають в чашку Петрі, так щоб ооцисти були повністю покриті розчином і рівномірно розподілилися по всій поверхні. Після дії препарату суспензію центрифугують, осад розбавляють водопровідною водою і вводять через зонд по 1мл 5-7-добовим курчатам, стерильним відносно кокцидій. Контроль за виділенням ооцист в посліді усіх груп кокцидій проводять щодня після зараження протягом 7-10 діб. Біопроба вважається негативною, якщо в посліді заражених курчат не було виділено ооцист кокцидій. У разі виявлення ооцист в посліді дослідних курчат дослідний препарат вважається неефективним. Якщо під час досліду в контрольній групі були виділені ооцисти, дослід повторювали. Цей спосіб може бути прототипом. Але він є недостатньо об'єктивним, так як формуються лише дві групи - дослідна та контрольна. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу кур при скринінгу хімічних препаратів як дезінвазійних засобів, що включає накопичення біомаси, обробку тест-культур розчинами хім. препаратів, центрифугування, проведення біопроби шляхом здійснення біопроби за допомогою формування 3-х груп: 1 - дослідна, яку заражають тест-культурою, 2 - контрольна, якій ентерально задають вірулентні збудники без хімічної обробки, 3 - контрольна група - стерильна, щоб забезпечити ефективність способу. Під час постановки біопроби першій контрольній групі курчат будуть ентерально задаватися вірулентні збудники кокцидіозу, які не піддавалися дії хімічних препаратів, на відміну від прототипу, де такої групи не існує. Друга контрольна група курчат буде стерильною. Це дає можливість дослідникам об'єктивно порівнювати результати, які будуть отримані у дослідного поголів'я з контролем та обробляти їх статистично. Отже проведені нами дослідження дозволяють зробити висновок, що спосіб, який заявляється відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. З птахогосподарств, неблагополучних по кокцидіозу, відбирають послід птиці, який досліджують на наявність ооцист кокцидій різних видів. Збудників з посліду ізолюють застосовуючи для флотації насичений розчин аміачної селітри (щільність - 1,3). Отриману біомасу кокцидій піддають очищенню в декілька етапів: великі механічні домішки видаляють шляхом фільтрування через металеве ситечко, з розміром чарунок 1мм2; дрібні домішки видаляють диференційним центрифугуванням матеріалу триразово за наступними режимами: перший раз - при 2000об/хв. на протязі 10 хвилин, другий - при 1500об/хв. на протязі 5 хвилин, третій - при 700об/хв. також протягом 5 хвилин активації супутньої мікрофлори суспензії найпростіших обробляють антибіотиками (пеніцилін із стрептоміцином по 1000ОД на 1см3 суспензії, в якій містилося 500 тисяч збудни 50748 4 ків) протягом 24 годин. Після відмивання біомаси від антибіотиків проводять споруляцію одержаних кокцидій в чашках Петрі на фільтрувальному папері, змоченому водою, при температурі +28°С. При проведенні біологічної проби формують три групи курчат сприйнятливого віку, стерильних відносно кокцидій: дослідну та дві контрольні по 5-7 голів у кожній. Для зараження дослідного поголів'я птиці готують суспензію найпростіших: беруть 2 мл суміші різних видів кокцидій курей, осаджують в пробірці центрифугуванням, зливають рідину до осаду й додають випробовуваний препарат в об'ємі 5мл. Після витримки in vitro встановленої оптимальної концентрації розчину і часу, що забезпечують найбільший відсоток руйнування ооцист, суспензію триразово відмивають водою шляхом центрифугування. Отриманою суспензією з оброблених найпростіших заражають дослідне поголів'я шляхом ентерального введення шприцем ємністю 2см3 в летальній дозі (200±5тис. ооцист на 1кг маси тіла). Кількість ооцист в 1см3 суспензії підраховують в камері Горяєва. Курчатам першої контрольної групи ентерально задають вірулентні збудники кокцидіозу, які не піддавались дії випробовуваного препарату, в летальній дозі. Курчата другої контрольної групи найпростіших не отримують та служать «чистим контролем». З моменту інвазування за птицею ведуть спостереження протягом 10 діб. Дезінвазійну дію випробовуваного препарату на ооцисти кокцидій оцінюють за показниками захворюваності на кокцидіоз, летальності та інтенсивності інвазії. Контроль за виділенням ооцист кокцидії проводять щоденно, відбираючи і досліджуючи послід від птахів. Біопроба вважається негативною, якщо у поголів'я дослідних курчат не реєструється клініка кокцидіозу і в посліді не виявляють ооцисти кокцидій, а в першій контрольній групі спостерігається захворювання, загибель птиці і висока інтенсивність інвазії (більше 1млн. ооцист в 1см3 посліду). Таким чином було розроблено спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу курей з метою пошуку хімічних препаратів, які володіють дезінвазійними властивостями у відношенні екзогенної стадії розвитку найпростіших. Приклад 1. Для підтвердження життєздатності та вірулентності оброблених 5% розчином «Кристал-900» збудників кокцидіозу в лабораторних умовах була проведена біологічна проба на сприйнятливому поголів'ї курчат. З цією метою було сформовано три дослідні та дві контрольні групи по 5 курчат 21-добового віку кросу «Хайсекс-білий». Безпосередньо перед проведенням біологічної проби була поставлена культура найпростіших різних видів на обробку 5% розчином «Кристал-900» в режимі експозицій: 24, 48 та 72 години. Після закінчення відповідних експозицій збудників кокцидіозу відмивали від хімічної речовини й готували їх водну суспензію, таким чином, щоб в її 1см3 знаходилась така кількість спорульованих ооцист, яка відповідала б 5 абсолютній летальній дозі (ЛД100). Курчатам трьох дослідних груп після перевірки їх на відсутність зараженості кокцидіозом та зважування, ентерально вводили підготовлені суспензії найпростіших, після відповідних експозицій, з розрахунку 1 см3 на 1кг маси тіла. Курчатам першої контрольної групи за допомогою шприця ентерально задавали збудники кокцидіозу, які не піддавалися дії 5% розчину «Кристал-900» в летальній дозі. Курчата другої контрольної групи найпростіших не отримували та служили «чистим контролем». Протягом всього досліду щоденно проводився нагляд за клінічним станом птиць усіх груп та відбір посліду для копроскопії. Всі загиблі впродовж досліду курчата, а також евтаназовані наприкінці досліду, були піддані розтину з метою реєстрації патологоанатомічних змін з відбором проб для паразитологічних досліджень. Облік досліду був проведений на десяту добу. При цьому було встановлено, що після введення птиці найпростіших, оброблених хімічним препаратом на протязі періоду спостережень, все поголів'я першої, другої та третьої групи захворіло на кокцидіоз, з яких 8 загинуло. Загиблу птицю піддавали патологоанатомічному розтину, відбирали внутрішні органи і в лабораторних умовах досліджували, встановлюючи патологоанатомічні зміни, характерні для кокцидіозу, а також проводили паразитологічні дослідження з метою виявлення ооцист кокцидій у вмісті кишечника або стадій їх розвитку у зішкребках із слизової оболонки. Що стосується інтенсивності інвазії, то її підвищення відмічали у всіх заражених птахів другої дослідної групи на четверту добу після зараження (1,45млн. ооцист в 1см3 посліду), а свого максимального значення цей показник досягав на сьому добу (6,23млн. ооцист в 1см3 посліду). Дані досліджень по біопробі представлені у таблиці 1. Одержані результати свідчили про те, що поголів'я першої контрольної групи також захворіло на кокцидіоз. На п'яту добу загинуло три голови. Патологоанатомічні зміни та паразитологічні дослідження, проведені в лабораторних умовах, підтвердили захворювання. Інтенсивність інвазії була схожа з дослідними групами. У курчат другої контрольної групи «чистий контроль» клінічного прояву захворювання та ооцист кокцидій у посліді не спостерігалося. Отже, за результатами біологічної проби оцінки ефективності хімічного препарату «Кристал900» на дезінвазійну активність щодо ооцист кокцидій різних видів, препарат можна вважати таким, що не спричиняє загибелі збудників кокцидіозу курей у випробуваних розведеннях та експозиціях. Приклад 2. Для підтвердження нежиттєздатності та авірулентності оброблених 5% розчином «Макси 50748 6 сан» збудників кокцидіозу в лабораторних умовах була проведена біологічна проба на сприйнятливому поголів'ї курчат. Для проведення біологічної проби, подібно попередньому прикладу, також використовували сприйнятливе поголів'я курчат, вільних від збудників кокцидіозу, з яких були сформовані дослідні та контрольні групи. Курчатам трьох дослідних груп після зважування ентерально вводили підготовлені суспензії найпростіших після обробки 5% розчином «Максисану» в режимі експозицій: 24, 48 та 72 години та послідуючої відмивки. Курчатам першої контрольної групи за допомогою шприця ентерально задавали збудники кокцидіозу, які не піддавались дії дезінфектанта в летальній дозі. Курчата другої контрольної групи найпростіших не отримували та служили «чистим контролем». Аналіз досліду був проведений на десяту добу (табл.2). При цьому було встановлено, що після введення птиці найпростіших, оброблених дослідним препаратом, у курчат трьох дослідних груп не реєстрували клінічного прояву захворювання та загибелі від кокцидіозу. Інтенсивність інвазії за період спостережень у курчат першої та другої групи не перевищувала 1млн. ооцист в 1см3 матеріалу. Така інтенсивність інвазії відповідає рівню кокцидіоносійства. У молодняка третьої дослідної групи ооцист кокцидій у посліді не фіксувалося. Контрольне поголів'я курчат, заражених вірулентними ооцистами, які не піддавалися дії хімічної речовини, захворіло на кокцидіоз. За період спостереження в ній загинуло троє курчат. Патологоанатомічні зміни та паразитологічні дослідження, проведені в лабораторних умовах, підтвердили захворювання на кокцидіоз. Інтенсивність інвазії досягала 6,31млн. ооцист в 1см3 посліду, що відповідало важкій формі захворювання. У курчат другої контрольної групи «чистий контроль» клінічного прояву захворювання та ооцист кокцидій у посліді не спостерігалося. Таким чином, в результаті проведеної біологічної проби встановлено, що негативний вплив препарату «Максисан» на збудників кокцидіозу курей проявлявся на високому рівні у 5% концентрації при експозиції 72 години. Отже, запропонований нами спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу курей з метою пошуку хімічних препаратів, які володіють дезінвазійними властивостями у відношенні екзогенної стадії розвитку найпростіших, є ефективним і дає найбільш об'єктивну оцінку препарату внаслідок застосування біопроби. Тільки перевіривши ефективність дії препарату в біопробі можна вважати препарат активним у відношенні ооцист кокцидій курей і рекомендувати для впровадження у промислове птахівництво. 7 50748 8 Таблиця 1 Спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу кур при скринінгу хімічних препаратів як дезінвазійних засобів № групи 1 2 3 Контроль «Чистий контроль» 1) Кількість Захворіло, птахів, голів голів 24 5 5 48 5 5 72 5 5 необроблена тест-культура 5 5 не заражені 5 Експозиції, години Загинуло, Максимальна інтенголів сивність інвазії1) 3 3 2 3 6230 6220 6200 6310 - тисяч ооцист в 1 мм3 матеріалу (посліду) Таблиця 2 № групи Експозиції години 1 2 3 24 48 72 необроблена тест-культура не заражені Контроль «Чистий контроль 1) Кількість птахів, голів 5 5 5 5 5 Захворіло Загинуло голів голів 5 3 Максимальна інтенсивність інвазії1) 560 380 6310 - тисяч ооцист в 1 мм3 матеріалу (посліду) Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601