Спосіб визначення овоцидної активності хімічних з’єднань на яйцях ascaridia galli

Спосіб визначення овоцидної активності хімічних з'єднань на яйцях Ascaridia galli, що включає 3 порушення структури яєць та дегенеративних змін у зародках, при необхідності проводять подальше культивування у вологих камерах при періодичній аерації для перевірки життєздатності і подальшого розвитку яєць після дії речовин. Другим етапом досліджень є встановлення дії робочих розчинів препаратів на тест-культури яєць, нанесених на тест-моделі поверхонь (дерево, бетон, цегла). На пластинки матеріалів наносять тонким шаром фекалії, а потім на поверхню суспензію яєць 1 обробляють розчином препарату. Після експозицій яйця вилучають шляхом зішкрібання в ємність з водою, відмивають триразово, мікроскопують і культивують за вищеназваною методикою. Оцінку дезінвазійної активності препаратів визначають виходячи із критерію кількості загиблих збудників паразитозів за показниками: високий рівень -90 - 100%, задовільний - 60 - 90%, незадовільний (низький) нижче 60%. Цей спосіб може бути найближчим аналогом, але недоліком даного способу є те, що Ascaridia galli і Ascaris suum відрізняються за циклом розвитку і біологічна проба для визначення життєздатності яєць Ascaridia galli може бути поставлена тільки на сприйнятливому поголів'ї курчат, вільному від гельмінтів. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення овоцидної активності хімічних з'єднань на яйцях Ascaridia galli, що включає на 1-ому етапі: отримання тест-культури, перевірку на життєздатність, біопробу, експозицію розчинів препаратів; на 2-ому етапі: встановлення дії робочих розчинів на тест-культури яєць, експозицію, зішкрібання яєць, відмивання, мікроскопію, культивування, оцінку дезінвазійної активності шляхом відмивання культури за допомогою центрифугування у пробірках з водою, центрифугування отриманого осаду з надосадовою рідиною у розчині аміачної селітри, проведення біопроби на сприйнятливому поголів'ї курчат вільних від гельмінтів, щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз способу, що заявляється та найближчого аналога вказує, що даний спосіб відрізняється від існуючого конкретною спрямованістю для проведення скринінгу хімічних речовин на яйцях Ascaridia galli, об'єктивністю визначення дезінвазійних властивостей і більш достовірним визначенням овоцидної активності деззасобів. Визначення овоцидної активності хімічних з'єднань на яйцях Ascaridia galli у кур здійснюють таким чином: Тест-культуру яєць гельмінтів одержують із гонад самок Ascaridia galli. Перед проведенням досліджень яйця мікроскопують і культивують у вологих камерах при температурі 27°С протягом 20-30 діб при періодичній аерації. Для підтвердження життєздатності личинок застосовують метод фарбування метиленовим синім і злегка підігрівають предметні скельця - живі личинки залишаються прозорими і при підвищенні температури рухаються, або проводять біопробу на вільних від гельмінтів курчатах сприйнятливого віку. Птиці ентерально за допомогою піпетки вводять суспензію яєць в кількості не менше 100 екземплярів. Через 21-25 діб проводять евтаназію і 49846 4 визначають наявність личинок в просвіті тонкого кишечнику. Хімічні речовини по їх дезінвазійній активності оцінюють послідовно, починаючи від концентрації 3% при експозиціях від 3 годин до кількох діб (24, 48, 72год.). При необхідності концентрацію збільшують або зменшують. Перед застосуванням препаратів водну суспензію яєць вносять на годинникові скельця (діаметр 100мм), які розміщені в чашках Петрі, залишки води видаляють фільтрувальним папером і заливають робочим розчином хімічних речовин. Після витримки експозицій яйця відмивають водою 3-5 разів, додають метиленовий синій і через 15хв. мікроскопують. При наявності живих личинок культури культивують далі при періодичній аерації і спостерігають за їх розвитком. При 100% загибелі (всі яйця і личинки синього кольору, нерухомі при підігріванні) за результатами мікроскопії проводиться біологічна проба на вільних від гельмінтів курчатах сприйнятливого віку: формують три групи по п'ять курчат - одна дослідна і дві контрольних. Дослідній групі задають за допомогою піпетки культуру яєць після обробки препаратом, першій контрольній групі задають культуру, яка не оброблялася, друга контрольна група курчат не заражається зовсім, є чистим контролем і служить для підтвердження того, що птиця утримувалась в однакових умовах. Доза на одну голову не менше 100 яєць і є умовно однаковою для всіх груп для більш достовірних результатів. Після зараження птицю утримують на протязі 21-25 діб, потім проводять евтаназію і підраховують кількість личинок у просвіті кишечника (тонкий відділ). Другий контроль повинен бути чистим. Овоцидну активність препарату визначають за різницею між контролем, який беруть за 100% і кількістю живих особин у дослідних курчат у відсотках по відношенню до контролю. Після чого проводять статистичну обробку. Другим етапом досліджень є встановлення дії визначених робочих розчинів препаратів на тесткультури яєць, нанесених на тест-моделі поверхонь розміром 10x10 см, які використані в птахівництві (метал, дерево, цегла). Наносять тонким шаром послід курей, а потім на поверхню суспензію яєць (тест-культуру). Зрошують розчином препарату із визначеного розрахунку і після експозиції послід з яйцями вилучають за допомогою шпателю, вносять в пробірки з водою, розмішують і центрифугують (1,5тис. об.хв. 3хв), потім осад з надосадовою рідиною центрифугується у розчині аміачної селітри (щільність 1,3). Яйця піднімаються на поверхню пробірок, знімаються металевою петлею та наносяться на предметні скельця для мікроскопії. Для кращої диференціації дегенеративних і структурних змін в яйцях і оболонках в краплі додається метиленовий синій, якщо яйця загинули оболонки і зародок фарбуються в синій колір, в живих яйцях личинки залишаються прозорими і рожевими. Якщо зустрічаються яйця з живими личинками поверхнева плівка відсмоктується за допомогою шприца в чисті пробірки, центрифугується з водою для нейтралізації флотаційного розчину (1:10), осад з культурою переноситься на годинникові скельця в чашках Петрі і культивуєть 5 49846 ся. При 100% загибелі інвазійних яєць для підтвердження результатів проводиться біологічна проба на вільних від гельмінтів курчатах сприйнятливого віку. Приклад За викладеним вище способом визначали овоцидну активність дезінфікуючого засобу «Максісан». Дезінвазійну дію визначали з використанням яєць аскаридій (A. galli). Тест-культуру яєць гельмінтів одержували із гонад самок аскаридій. Дію дослідного препарату вивчали в трьох та п'ятивідсоткових концентраціях при експозиціях 3, 6, 24 і 48 годин. Для визначення змін в дослідних культурах (структурні та дегенеративні зміни оболонок, зародку та личинки) одночасно в однакових умовах витримували контрольну культуру в дистильованій воді. Для визначення життєздатності яєць гельмінтів застосовували метод фарбування метиленовим синім і злегка підігрівали предметні скельця - живі личинки при підвищенні температури рухалися. Для остаточної перевірки дезінвазійної дії дослідного препарату на інвазійні елементи була поставлена біопроба на вільних від паразитів курчатах 21-добового віку. Ступінь інвазування птиці гельмінтами після дії дезрозчину на інвазійну культуру визначали шляхом евтаназії на 18-21 добу після зараження і виявляли личинок в просвіті дванадцятипалої кишки. При лабораторному дослідженні дії дослідного препарату на яйцях аскаридій встановлено, що після витримки експозицій 3 і 6 годин 3% і 5% розчинів в дослідних культурах видимих структурних і дегенеративних змін в оболонках і зародку не спостерігалось. В культурах, які оброблялися 3% розчином при експозиції 6 годин яйця з личинками почали гинути лише на 16 добу, а на 25 добу всі яйця загинули. В культурах, які оброблялися 5% розчином в експозиції 6 годин яйця почали гинути на 14 добу і лише на 24 добу загинули всі культури. Проте, після обробки 3% концентрацією дослідного препарату в експозиції 24 години загинуло біля 50% інвазійних яєць і вже на 6 добу загинула вся дослідна культура. В культурі яєць, яка оброблялася 5% розчином в експозиції 24 години загинуло більше 90% збудників. В експозиції 48 годин після обробки 3% і 5% розчином препарату заги 6 нула вся культура (яйця темно-синього кольору після фарбування метиленовим синім, личинки нерухомі). Таким чином, були визначені 3 та 5% концентрації і 24 та 48 годинні експозиції дії дослідного препарату для проведення біопроби на сприйнятливому поголів'ї птиці. З вільних від гельмінтів курчат яєчного напрямку продуктивності 21-добового віку було сформовано 6 груп, по п'ять голів в кожній. Підготовану культуру інвазійних яєць обробляли розчинами дослідного препарату у визначених концентраціях та експозиціях з послідуючим відмиванням збудників від дезрозчину. Дослідні групи курчат були інвазовані (150-200 яєць на одне курча) у наступному порядку(таб. 1): Курчат групи №5 заражали культурою яєць, які не оброблялися дезінфекційними розчинами. Група №6 була сформована для підтвердження стерильності утримання всіх груп. Через три тижні проводили евтаназію птиці (за циклом розвитку А. galli через 18-21 добу личинки виходять у просвіт дванадцятипалої кишки) і визначали інтенсивність інвазії. За отриманими результатами підраховували овоцидну активність препарату порівняно з контролем, виходячи із кількості розвинених паразитів. Овоцидна активність дослідного препарату представлена в таблиці 2: При збільшенні концентрації препарата до 5% і при подовженні експозиції до 48 годин овоцидна активність його достовірно збільшилася на 7,6% (Р 0,95). За другим етапом досліджень встановлювали овоцидну дію 5% розчину препарату при експозиціях 24 і 48 годин на тест-культурах яєць, нанесених на тест моделі поверхонь розміром 10x10см (метал, дерево, цегла) згідно описаного способу. Аналіз проведеного лабораторного досліду свідчив про абсолютну овоцидну дію розчину препарату як і в першому етапі проведення лабораторних досліджень. Отримані дані свідчили про те, що дослідний препарат у 5% концентрації починаючи з експозиції 24 години, проявляє високу дезінвазійну активність щодо яєць аскаридій (A. galli). Таблиця 1 Спосіб визначення овоцидної активності хімічних з'єднань на яйцях ASCARIDIA GALLI № групи 1 2 3 4 5 6 Препарат, концентрація і експозиція Максісан, 3% розчин, 24 години Максісан, 3% розчин, 48 годин Максісан, 5% розчин, 24 години Максісан, 5% розчин, 48 годин Контроль (зараження чистою культурою) Чистий контроль (птиця не заражалась) 7 49846 8 Таблиця 2 Спосіб визначення овоцидної активності хімічних з'єднань на яйцях ASCARIDIA GALLI № групи 1 2 3 4 5 Концентрація, % 3 5 контроль Експозиція, год Овоцидна активність, % 24 90,2±2,04* 48 93,5±2,04 24 94,6±1,72 48 97,8±1,32 Культура не оброблялася Примітка: *- Р≥0,95, порівняно з даними 4 групи Комп’ютерна верстка Л. Купенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601