Спосіб прижиттєвої діагностики лейкозу великої рогатої худоби двостадійною полімеразною ланцюговою реакцією

Спосіб прижиттєвої діагностики лейкозу великої рогатої худоби двостадійною полімеразною 3 53223 лькості виділеної ДНК із лімфоцитів крові внаслідок чого попереджається отримання псевдонегативних результатів. Крім того, використання ПЛР в реальному часі не вимагає проведення розділення продуктів ампліфікації в агарозному гелі (візуалізація результатів відбувається на моніторі комп'ютеру), що попереджає контамінацію робочого середовища продуктами ампліфікації та робить спосіб діагностики лейкозу ВРХ методом д.с.-ПЛР більш безпечним. Лейкоз (рак крові) великої рогатої худоби - це хронічне захворювання, що викликається ретровірусом лейкозу (bovine leukaemia virus, BLV). Згідно діючої «Інструкції по профілактиці та оздоровленню великої рогатої худоби від лейкозу», основними методами прижиттєвої діагностики є серологічні - реакція радіальної імунодифузії (РІД) та імуноферментний метод (ІФА), а також метод ПЛР. Міжнародне епізоотичне бюро, рекомендує здійснювати діагностику лейкозу за допомогою ПЛР в модифікації nested (двохстадійна ПЛР), яка є більш чутливою порівняно із одностадійною. Однак висока чутливість методу є одночасно і його недоліком через високий ризик контамінації робочого середовища продуктами ампліфікації. ПЛР в реальному часі - одна із сучасних модифікацій ПЛР, в основу якої покладено використання флуоресцентних барвників, що дає можливість спостерігати за накопиченням ПЛР-продукту в реальному часі на моніторі комп'ютеру, в зв'язку з чим не має необхідності проводити розділення продуктів ампліфікації в агарозному гелі. Запропонований спосіб здійснюються таким чином: кров ВРХ відбирають із яремної, молочної чи хвостової вени в одноразові пробірки із консервантом (0,5% розчин ЕДТА) у кількості 5мл. Виділення ДНК: відібрати необхідну кількість одноразових пробірок, включаючи негативний контроль виділення, і промаркувати їх; внести в кожну пробірку по 300мкл лізуючого буферу і 100мкл крові, (замість крові в пробірку для негативного контролю виділення внести 100мкл буферу для елюції ДНК); проби ретельно перемішати на вортексі і прогріти 5хв при 65°С; осадити краплі на вортексі; додати 25мкл сорбенту ДНК ретельно перемішати на вортексі та залишити пробірки у штативі на 2хв.; повторити процедуру та залишити 4 в штативі на 5хв.; осадити сорбент при 5000об/хв. протягом 30с. відібрати супернатант у колбууловлювач, використовуючи вакуумний насос та окремий наконечник для кожної проби; додати в зразки по 300мкл розчину для відмивання 1, перемішати на вертексі до повного ресуспендування сорбенту; осадити сорбент центрифугуванням при 5000об/хв. протягом 30с.; відібрати супернатант, використовуючи вакуумний насос та окремий наконечник для кожної проби; додати в кожну пробірку по 500мкл розчину для відмивання 2 (окремими наконечниками), ретельно ресуспендувати на вортексі і знову осадити при 5000об/хв. протягом 30с.; видалити супернатант із кожної пробірки окремим наконечником; повторити процедуру відмивання; ретельно відібрати супернатант і висушити осад сорбенту при відкритих кришках мікропробірок у термостаті при 65°С протягом 5-7хв. (до повного випаровування рідини); ресуспендувати сорбент у 50мкл буферу для елюції ДНК (ТЕ буфер), перемішати на вортексі та помістити в термостат при 65°С на 5-6хв., струшуючи на вортексі кожну хвилину; осадити сорбент на мікроцентрифузі при 13000об/хв. протягом 1хв. Супернатант містить очищену ДНК, яку використовують у ПЛР. Проведення першої стадії ПЛР. Приготувати реакційну суміш для досліджуваних зразків із розрахунку 19,7мкл ПЛР-суміші та 0,3мкл суміші ферментів (Taq+UDG) на один зразок. 0,2мл мікропробірки для ПЛР помістити у спеціальний штатив із охолодженням та промаркувати їх; у мікропробірки за допомогою автоматичного дозатора послідовно внести по 20мкл ПЛР суміші; та додати по 5мкл виділеної ДНК кожного із зразків; у мікропробірки, які призначені для негативного контролю, внести по 5мкл реактиву «негативний контроль», який містить ДНК тварин вільних від провірусу лейкозу; у мікропробірки, які призначені для позитивного контролю, внести по 5мкл реактиву «позитивний контроль», який містить ДНК тварин у яких виявлено провірус лейкозу; в останню чергу у мікропробірки, що призначені для NTC контролю, внести по 5мкл деіонізованої води; помістити мікропропробірки в ампліфікатор та задати наступний температурний профіль (табл. 1); після закінчення реакції мікропробірки відкрутити на мікроцентрифузі. Таблиця 1 Температурний профіль для першої стадії ПЛР Стадія 1 2 3 4 5 Режим ампліфікації Температура, °С 50 94 94 53 72 94 58 72 72 Час, с 600 600 30 30 60 30 30 60 300 Процес Число циклів активація UNG активація полімерази денатурація ДНК відпалювання праймерів елонгація денатурація ДНК відпалювання праймерів елонгація елонгація 1 1 15 25 1 5 53223 Проведення другої стадії ПЛР. Приготувати реакційну суміш для досліджуваних зразків із розрахунку 22,3мкл ПЛР-суміші та 0,2мкл ферменту Taq-полІмерази на один зразок; 96-лунковий планшет для ПЛР, або відповідну кількість 8-ми лункових стрипів помістити у спеціальний штатив із охолодженням; у лунки планшету за допомогою автоматичного дозатора послідовно внести по 22,5мкл ПЛР суміші та додати по 2,5мкл ПЛРпродукту першої стадії ПЛР кожного із зразків; у лунку, які призначена для негативного контролю, внести 2,5мкл ПЛР-продукту «негативний контроль; у лунку, яка призначена для позитивного 6 контролю, внести 2,5мкл ПЛР-продукту «позитивний контроль»; у одну лунку, що призначена для NTC контролю, внести 2,5мкл ПЛР-продукту «NTC» (перевірка чистоти реактивів першої стадії ПЛР); у другу лунку, що призначена для NTC контролю, внести 2,5мкл деіонізованої води (перевірка чистоти реактивів другої стадії ПЛР); включити прилад АВІ Prism SDS 7000, відкрити дверцята приладу та помістити реакційний планшет у блок для зразків; відкрити програму АВІ Prism 7000, створити планшетний документ, згідно настанови до приладу. задати температурний профіль (табл.2). Таблиця 2 Температурний профіль ампліфікації для другої стадії д.с. ПЛР (сірим кольором відмічено стадію на якій здійснюється збір даних флуоресценції) Стадія 1 2 Режим ампліфікації Температура, °С Час, хв. 94 9 95 0,2 60 1 72 0,3 Інтерпретація одержаних результатів: основним критерієм оцінки отриманих результатів є визначення граничного циклу (Ct), що характеризує певний цикл ПЛР-РЧ, на якому спостерігається статистичне достовірне збільшення флуоресценції у порівнянні з фоновим рівнем (Фіг. Криві ампліфікації ПЛР-РЧ: позитивний зразок - крива «А» (детекція по FAM) та «Б» (детекція по JOE); негативний зразок - крива «В» (детекція по JOE) та «Д» (детекція по FAM). Для визначення провірусної ДНК вірусу лейкозу проводиться аналіз кривих ампліфікації контролів та невідомих зразків: у позитивному контрольному зразку повинна відбуватись ампліфікація як гену-мішені (канал FAM) так і ендогенного контролю (канал JOE); у негативному контрольному зразку повинна відбуватись ампліфікація тільки ендогенного контролю (канал JOE); у NTC-контролях не повинно відбуватись ампліфікації по жодному із каналів детекції; зразок вважається позитивним, якщо відмічається ампліфікація гену-мішені (FAM) Процес Число циклів активація полімерази денатурація ДНК відпалювання праймерів елонгація 1 40 при значенні Ct 30 та ендогенного контролю (JOE) при значенні Ct 35; негативним вважається зразок, у якого відмічається ампліфікація тільки ендогенного контролю (JOE) при значенні Ct 30. Результати аналізу не враховуються: при відсутності ампліфікації по каналам FAM або JOE у позитивного контролю; при відсутності ампліфікації по каналу JOE у негативного контролю; при відсутності ампліфікації по каналу (JOE) у зразка, що досліджується, або при його ампліфікації із значенням Ct 35; при ампліфікації по каналу FAM Ct 30 у зразка, що досліджується. При великій розбіжності результатів (значення Ct) у повторах (SD > 0,5). В цих випадках проводиться повторне виділення ДНК та постановка д.с. ПЛР. Приклад Для вивчення чутливості д.с.-ПЛР в реальному часі порівняно із о.с.-ПЛР в реальному часі було проведено дослідження 90 зразків крові отриманих від тварин які позитивно реагували в ІФА (табл. 3). Таблиця 3 Чутливість д.с.-ПЛР Метод діагностики д.с.-ПЛР о.с.-ПЛР Результат позитивний 90 69 В результаті дослідження було отримано 69 позитивних результати в о.с.-ПЛР в реальному часі (77%), та 90 позитивних результати в (100%) в д.с.-ПЛР в реальному часі. Виходячи з результатів % 100 77 негативний 0 21 % 0 23 дослідження можна сказати, що запропонований спосіб дозволяє виявляти на 23% більше інфікованих тварин ніж о.с-ПЛР в реальному часі. 7 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 53223 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601