Спосіб визначення мутагенного ефекту важких металів

Спосіб визначення мутагенного ефекту важких металів, який включає облік показників порушення ембріонального розвитку рослин та свідчення за даними обліку про наявність мутагенного ефекту, який відрізняється тим, що для визначення віддалених та безпосередніх наслідків впливу факторів середовища, зокрема важких ме талів, використовують як тест-систему частоту та спектр аномалій для вже сформованого зародкового апарата, а саме гістогенна редукція ендосперму, розширення шару епідермісу зародку, розростання палінової оболонки, анізокотилія, Винахід відноситься до фітоембрюлопі, фітотоксикологм, охорони генофонду рослин природної флори та може бути використаний для тестування генотоксичних ефектів важких металів на основі ідентифікування індукованих ними аномалій ембріонального розвитку, а також для визначення оптимальних концентрацій важких металів, прогнозування наслідків мутагенних трансформацій та якостей насінин та рослин природної флори у наступних поколіннях ВІДОМІ способи бюіндикацм мутагенів грунтів за допомогою реакції пилку індикаторних рослин, де визначається ступінь дефектності пилкових зерен амфіміктичних квіткових рослин, які використовуються як індикаторні [1,2] Можливість використання бюшдикаційних досліджень при проведенні ГІГІЄНІЧНОЇ оцінки якості навколишнього середовища надає великого значення розробці експресних високочутливих методів Для аналізу забруднення грунтів мутагенами найбільш вдалим тест-об'єктом є рослини [1] Існує спосіб визначення мутагенного ефекту факторів середовища за допомогою ідентифікації індукованих пестицидами аномалій ембріонального розвитку рослин, де вивчали спектр порушень ембріогенезу на 1 - 2 - й день квіткування та обліку підлягали такі показники, як старіння яйцевого апарату, асинхронний розвиток зародку та ендосперму та поліембріонія При наявності мутагенно го ефекту факторів середовища робили висновок, якщо значення першого з перелічених показників зменшувалося, а другого та третього збільшувалося у порівнянні з контролем [3] Недоліками цього способу є мала достовірність при аналізі проб саме у перші дні квіткування з урахуванням високої морфологічної пластичності квітки та генеративного апарату, неточна означеність мутагенного ефекту та використання даних тільки пестицидного забруднення, а точніше лише концентрації НІ\І2, що не дає повну картину мутагенного характера субстрату В основу винаходу поставлена задача поліпшення методів ембріональної оцінки навколишнього середовища за допомогою рослин природної флори на прикладі Tnpleurospermum perforatum (Merat) M Laipz (Asteraceae Dum ), де обліку підлягають не впроваджені раніше показники, а рослинні збори проводять після квіткування, забезпечується можливість встановити рівень та спектр аномалій у розвитку ембріональних структур, також виявити не тільки інтегративну, а й дискретну ознаку дії мутагенних факторів середовища, зокрема важких металів, на ембріональний розвиток першого та наступних поколінь, та за рахунок цього використання способу дозволить більш точно прогнозувати наслідки мутагенних трансформацій, якостей насінин та рослин природної флори, оцінити специфіку металевого забруднення на техно тератологічна ПОЛІКОТИЛІЯ та тератологічна СХІЗОКОТИЛІЯ, цілковите зменшення зародку, гемітрикотилія, гемітетракотилія, складання ендотести з палісадного шару близьких до кубічних клітин, за якими визначають ступінь генотоксичності мутагенних факторів середовища, в тому числі важких металів, та проводять елементний аналіз специфіки впливу окремих металів ю СО ГО Ю 53375 генно змінених територіях Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення мутагенного ефекту важких металів, який містить облік показників порушення ембріонального розвитку рослин та свідчення за даними обліку про наявність мутагенного ефекту, ВІДПОВІДНО винаходу для визначення віддалених та безпосередніх наслідків впливу факторів середовища, зокрема важких металів, використовують як тест - систему частоту та спектр аномалій для вже сформованого зародкового апарату, а саме гістогенна редукція ендосперму, розширення шару епідерміса зародку, розростання палінової оболонки, анізокотілія, тератологічна ПОЛІКОТІЛІЯ та тератологічна СХІЗОКОТІЛІЯ, цілковите зменшення зародку, гемітрикотілія, гемітетракотілія, складання ендотести з палісадного шару близьких до кубічних клітин, за якими визначають ступінь генотоксичності мутагенних факторів середовища, в тому числі важких металів, та проводять елементний аналіз специфіки впливу окремих металів Спосіб оснований на тому, що визначення віддалених та безпосередніх наслідків впливу факторів середовища, зокрема важких металів, використовують як тест - систему частоту та спектр аномалій для вже сформованого зародкового апарату, а саме гістогенна редукція ендосперму, розширення шару епідерміса зародку, розростання палінової оболонки, анізокотілія, тератологічна ПОЛІКОТІЛІЯ та тератологічна СХІЗОКОТІЛІЯ, цілковите зменшення зародку, гемітрикотілія, гемітетракотілія, складання ендотести з палісадного шару близьких до кубічних клітин, за якими визначають ступінь генотоксичності мутагенних факторів середовища в тому числі важких металів та проводять елементний аналіз специфіки впливу окремих металів При цьому найбільш інформативними показниками є гістогенна редукція ендосперму (ГРЕ), розширення шару епідерміса зародку (РШЕЗ), розростання палінової оболонки (РГО), анізокотілія (А), тератологічна ПОЛІКОТІЛІЯ (ТП) та тератологічна СХІЗОКОТІЛІЯ (ТС) Гістологічна ВІДПО ВІДНІСТЬ з'ясована за літературними джерелами [4 -7] Приклад Вказаний спосіб визначення мутагенного ефекту важких металів було проведено на рослині Tnpleurospermum perforatum (Merat) M Laipz (Asteraceae Dum), що вирощували на території промислових майданчиків Артемівського та Костянтинівського районів Донецької області наступних модульних зон Артемівський завод по переробці кольрових металів (МЗ - 3), Артемівський машинобудівельний завод (МЗ - 4), Артемівський завод "Доріндустрія" (МЗ - 5), Артемівський кераміко - трубний комбінат (МЗ - 6), Часовоярський вогнетривкий комбінат (МЗ - 7), Артемівський скляний завод їм Артема (МЗ - 8), Костянтин і вський завод "Автоскло" (МЗ - 9), Костянтинівський механізований скляний завод (МЗ - 10), Костянтинівський завод "Укрцинк" (МЗ - 11), територія залізничного вокзалу м Костянтинівка (МЗ - 12) та в контрольних фонових умовах, де концентрації важких металів в грунтах були на рівні фона для Донецької області с Серебрянка (МЗ - 1) та с Званівка (МЗ - 2) Обрані рослини з контрольних місць зростання додатково вирощували в лабораторних умовах на нітратних металоносних субстратах з концентраціями РЬ - 500, Zn - 500, Cd -10, Ni -300, Cr - 300, Mo - 10, Fe - 200, Mn - 4000, Cu - 300, Hg 5 мг/кг Вміст металів у субстраті обумовлений гранично допустимими концентраціями [8 - 10] з поправкою на місцеві стандарти та фонові рівні [11] Повторність лабораторного експерименту дорівнювала 5 Дослідження проводили на рослинах першого, другого, третього та четвертого поколінь Для вивчення спектру порушень ембріонального розвитку була обрана найбільш стабільна та стандартизована стадія - кінець квіткування Для аналізу використовували 300 насінин в контрольних варіантах та 200 - у досліджених модульних зонах ПОСТІЙНІ препарати готували за загально прийнятими цитологічними методиками [12, 13] Товщина зрізів - 10 мкм, фарбування гематоксиліном за Гейденгайном В табл 1 представлені найбільш інформативні показники спектру аномалій від загальної КІЛЬКОСТІ порушень (частота різних типів структурних аномалій в залежності від місцезростання) Таблиця 1 Варіант МЗ-1 (контроль) МЗ-2 (контроль) МЗ-3 МЗ-4 МЗ-5 МЗ-6 МЗ-7 МЗ-8 МЗ-9 МЗ-10 МЗ-11 МЗ-1 2 Частота аномальних порушень, М±т 3,01 ±0,02 4,02±0,01 62,04±0,51 57,27±0,49 42,16±0,40 38,45*0,31 44,98±0,40 45,19±0,31 50,42±1,01 49,90±0,90 69,71±1,12 48,30±0,44 Спектр порушень, % ГРЕ 50 50 ЗО 23 40 5 20 20 12 5 5 3 Примітка М - середнє арифметичне, m - похибка РШЕЗ 2 10 15 14 5 ЗО 28 11 7 12 РГО 25 А 40 15 10 ЗО 13 15 15 5 70 7 18 12 20 21 35 19 15 13 4 60 ТП 5 10 5 16 10 10 20 17 6 3 ТС 1 20 5 5 10 5 9 40 5 7 ІНШІ 25 50 4 10 5 9 7 1 1 9 3 8 53375 З табл 1 видно, що КІЛЬКІСТЬ аномальних порушень у дослідних зонах значно більше від контролю Результати частоти зустрічаєм ості достовірні на 95% - му рівні Ступінь трансформованої зародкових елементів залежить від територіального розташування та міста збору ембріологічного матеріалу В контролі присутні деякі аномалії, що обумовлено нормальною генетичною гетерогенні 6 стю насінного матеріалу, та багато з типів порушень відсутні взагалі, тоді як у дослідних зонах зустрічаються усі типи означених аномалій В табл 2 представлені дані лабораторного експерименту - безпосереднього впливу важких металів на ембріональні структури тест - рослини (вплив нітратних форм важких металів на ступінь аномальності ембріональних елементів) Таблиця 2 Метали РЬ Zn Cd Ni Cr Mo Fe Mn Cu Hg ГРЕ 1 1 91 10 20 17 1 15 3 РШЕЗ 1 20 10 10 10 24 З табл 2 видно, частота появи аномалій специфічна в залежності від чинника - важкого металу Найбільш інформативною при забрудненні свинцем є ознака анізокотілм, цинком - розростання палінової оболонки, кадмієм - гістогенна редукція ендосперму, залізом - тератологічна СХІЗОКОТІлія та міддю - тератологічна ПОЛІКОТІЛІЯ Вплив нікеля, хрому, молібдена, марганцю та ртуті не несе цілеспрямованого ефекту для вивчених структур Позитивний ефект проявляється втому, що на відміну від відомого запропонований спосіб дозволяє виявити мутагенний вплив важких металів на більш віддалені етапи онтогенезу рослин Він має можливість встановити рівень та спектр аномалій у розвитку ембріональних структур та виявити не тільки інтегративну, а й дискретну ознаку дії мутагенних факторів середовища на ембріональний розвиток першого та наступних поколінь Використання способу дозволить більш точно прогнозувати наслідки мутагенних трансформацій та якостей насінин та рослин природної флори, оцінити специфіку металевого забруднення на техногенно змінених територіях Джерела інформації 1 Нечкина М А , Журков В С Способ биоиндикации мутагенов почвы // Гигиена и санитария 1997 - № 1 -С 48-49 2 А с 1725785 СССР МКИ А 01 Н 1/00 Способ определения интегрального эффекта неблагоприятных факторов внешней среды / Нечкина М А , Куприянов П Г -1992 - № 14 - С 10 3 А с 1463189 СССР МКИ А 01 G 7/00 Способ определения мутагенного эффекта факторов среды / Попа Н Е , Закржевская А М - 1989 - № 9 Спектр порушень, % pro А 2 92 93 2 1 15 15 20 25 10 23 2 22 15 4 13 17 ТП 4 3 1 20 10 10 3 18 92 7 ТС 1 2 2 15 15 20 92 10 26 ІНШІ 1 2 5 10 2 10 4 10 - С 12 (прототип) 4 Эмбриология цветковых растений Терминология и концепции / Под ред Т Е Батыгиной Генеративные органы цветка - СПб Мир и семья, 1994-Т 1 -320с 5 Эмбриология цветковых растений Терминология и концепции / Под ред Т Е Батыгиной Семя -СПб Мир и семья, 1997 -Т 2 -823с 6 Левина Р Е Морфология и экология плодов -Л Наука, 1987 -160с 7 Макрушин Н М Основы гетеросперматологии -М Агропромиздат, 1989 -287 с 8 Дудик А М Временные методические рекомендации по геолого - экологическим работам в пределах горнопромышленных районов Украины -Донецк Б и , 1992 - 105с 9 Дорошко Т Ю Предельно допустимые концентрации тяжелых металлов в почве и ее защита от загрязнения // Медицинский журнал Узбекистана -1991 - № 7 - С 40-42 ЮКабата - Пендиас А, Пендиас X Микроэлементы в почвах и растениях - М Мир, 1989439 с 11 Сафонов А И Особенности локализации некоторых металлов - токсикантов в почвах северных промышленных узлов Донбасса // Экологическая и техногенная безопасность Сб научн, тр Международн Научно - практ конференции -Харьков Изд - во Харьк Ин-та социального прогресса, 2000 - С 131-135 12 Паушева З П Практикум по цитологии растений - М Агропромиздат, 1988 - 271 с 13 Барыкина Р П , Веселова Т Д , Девятов А Г Основы микроскопических исследований в ботанике - М Наука, 2000 -128 с 53375 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24