Спосіб одержання імунологічного препарата для алергодіагностики кандидозної інфекції

Спосіб одержання алергодіагностичного препарата кандидозної інфекції, що включає культивування біомаси дріжджеподібних грибів роду Candida albicans, їх обробку 3-5 % розчином натрію гідроксиду, розділення рідкої та твердої фаз переважно центрифугуванням з подальшою обробкою надосодової рідини 0,2-1,5 М розчином орга 3 кГц та експозиції 90 хвилин, фільтрацію крізь мембрану "Владіпор МФА-МА № 3" за допомогою вакуум насосу. Відфільтрований дезінтеграт містить алергени гриба. Недоліком наведеного способу є недостатньо висока активність, відсутність методів очищення та стандартизації препарату. Завданням корисної моделі є розробка раціонального, відносно швидкого, економічно обґрунтованого способу одержання алергодіагностичного препарату з високою активністю при імунодіагностиці кандидозної інфекції. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання алергодіагностичного препарату кандидозної інфекції, що включає культивування дріжджеподібних грибів роду Candida albicans, їх обробку 3-5 % розчином натрію гідроксиду, розділення рідкої та твердої фаз переважно центрифугуванням з подальшою обробкою надосадової рідини 0,5-1,0 М розчином органічної або 0,1-1,0 М розчином мінеральної кислоти з подальшим центрифугуванням, осадженням, промиванням, фракціюванням та ліофілізацаєю цільового продукту, корисною моделлю передбачено, що обробку розчином натрію гідроксиду проводять однократно у поєднанні з постійним перемішуванням за допомогою мішалки зі швидкістю обертання 1000-1500 об/хв температурі не вище 50-60 °С протягом 4-8 годин, з подальшою стерилізуючою фільтрацією та наступною однократною обробкою фільтрату 0,2-1,5 М розчином органічної або 0,05-1,0 М розчином мінеральної кислоти до утворення рН 4,0-4,2, після центрифугування з надосодової рідини осаджують проміжний продукт, розчиняють у фосфатному буфері рН 7,2-7,8, проводять діаліз проти дистильованої води, піддають гель-хроматографії та виділяють цільовий продукт у діапазоні 15-300 кД. Корисною моделлю передбачено одночасне використання механічної дезінтеграції клітин гриба шляхом енергійного перемішування з дією натрію гідроксиду. Поєднання фізико-хімічних методів прискорює процес дифузії та підвищує проникність клітинних оболонок. При застосуванні даної комбінованої технології не потрібно проводити процес при підвищеній температурі, не потрібно проводити багатократне повторення стадії обробки клітин у лужних умовах з подальшим розділенням фаз тому, що запропонований спосіб дозволяє за менший час одержувати більш високі виходи діючих речовин, які мають низьку реактогенність та відрізняються високою активністю при алергодіагностичних реакціях. Всі ознаки заявленого способу визначені експериментальним шляхом і забезпечують економічну доцільність здійснення способу та одержання ефективного алергодіагностичного препарату кандидозної інфекції. Спосіб одержання алергодіагностичого препарату полягає у наступному. Культури дріжджеподібного гриба роду Candida albicans висівають у пробірки з агаром Сабуро та культивують у термостаті при температурі 28 °С протягом 2-х діб. Одержану культуру змивають розчином натрію хлориду та висівають у 54687 4 матраци з агаром Сабуро. Далі проводять культивування у термостаті при температурі 28 °С протягом 10-18 діб. Через 5-6 діб культуру з кожного матрацу перевіряють на чистоту шляхом мікроскопування. Одержану культуру змивають розчином натрію хлориду. Клітини гриба відділяють від розчину натрію хлориду центрифугуванням протягом 30 хвилин при 5000-6000 об/хв. Отриманий осад - біомасу грибів Candida albicans висушують і використовують для одержання діючих речовин шляхом руйнування клітин та вивільнення внутрішньоклітинного матеріалу. Руйнування клітин збудника кандидозу проводять за допомогою фізико-хімічних методів. Це обумовлено будовою клітини гриба, передусім його оболонки, яка суттєво відрізняється від оболонки бактерій, а також з особливостями її хімічного складу. Для цього використовують механічну дезинтеграцію клітин гриба шляхом енергійного перемішування у поєднанні з хімічним агентом - гідроксидом натрію. Подрібнену суху біомасу грибів обробляють 35 % водним розчином гідроксиду натрію у поєднанні з постійним перемішуванням за допомогою мішалки зі швидкістю обертання 1000-1500 об/хв температурі не вище 50-60 °С. Швидкість обертання мішалки 1000-1500 об/хв є оптимальною величиною, яка забезпечує раціональне використання електроенергії та руйнування клітин гриба. Збільшення кількості обертів затрачує більше електроенергії та не забезпечує пропорційного прискорення руйнування клітин, а навіть може призвести до утворення "мертвих зон". Зменшення кількості обертів призводить до уповільнення руйнування клітин гриба, а електроенергія затрачується майже так само. Звільнення від зруйнованих та незруйнованих вегетативних та спорових клітин проводять методом стерилізуючої фільтрації на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,45 мкм та 0,22 мкм. Одержаний фільтрат містить алергени, його обробляють 0,5-1,0 М розчином органічної або 0,1-1,0 М розчином мінеральної кислоти, поступово доводячи рН середовища до значення 4,04,2. Далі проводять розділення твердої та рідкої фази за допомогою центрифугування. З надосадової рідини осаджують 98 % оцтовою кислотою діючи речовини, розчиняють у підлуженому фосфатному буфері рН 7,2-7,8, проводять діаліз проти дистильованої води та піддають гельхроматографії на колонках з сефадексом G-75 або молселектом. Фракції, очищені від імунологічно інертного баласту, елюються під контролем спектрофотометрії при 280 нм у вигляді першого піку, відповідно вільному об'єму гелю. Цільовий продукт виділяють у діапазоні 15-300 кД. Після перевірки стерильності та нешкідливості одержаний препарат стандартизують за вмістом білкового азоту (із розрахунку 0,5 млг на одну діагностичну дозу препарата), піддають ліофільній сушці. Одержують суху порошкоподібну речовину, легко розчинну у фосфатному буфері або фізіологічному розчині. Специфічну активність одержаного препарату перевіряють методом внутришньошкіряних проб 5 на гвінейських мурчаках, сенсибілізованих культурою гомогенного штаму гриба. Алергодіагностичний препарат, одержаний за заявленим способом, містить полісахариди та білки, які представлені складними полімерними структурами і частково вільними мономерами. Полісахариди представлені моносахаридними елементами: манозою, у меншій кількості глюкозою, галактозою, ксилозою. Таким чином алергодіагностичний препарат, одержаний за заявленим способом, містить у складі всі діючи речовини, необхідні для забезпечення високої діагностичної активності і виключає необхідність створення комплексних препаратів. Алергодіагностичний препарат кандидозної інфекції, одержаний за заявленим способом, може бути використаний безпосередньо або у інших лікарських формах: ліофілізованій, розчину для ін'єкцій, може використовуватися для створення діагностичного пастирю тощо. Корисна модель ілюструється прикладами. Прикладі. Одержання алергодіагностичного препарату кандидозної інфекції. Культури дріжджеподібного гриба роду Candida albicans штаму АТТС 10231 висівали у пробірки з агаром Сабуро та вирощували у термостаті при температурі 28 °С протягом 2 діб. Одержану культуру штаму змивали розчином натрію хлориду, висівали у матраци з агаром Сабуро та культивували у термостаті при температурі 28 °С протягом 12 діб. Отриману культуру змивали розчином натрію хлориду. Клітини гриба відділяли від розчину натрію хлориду центрифугуванням протягом 30 хвилин при 5000 об/хв. Одержаний осад біомасу грибів висушували, подрібнювали та обробляли 4,5 % розчином гідроксиду натрію у поєднанні з постійним перемішуванням за допомогою мішалки зі швидкістю обертання 1000-1500 об/хв температурі не вище 50-60 °С протягом 6 годин. Звільнення від зруйнованих та незруйнованих вегетативних та спорових клітин проводили методом фільтрування крізь мембрані фільтри з діаметром пор 0,45 мкм та 0,22 мкм. Одержаний фільтрат обробляли 0,25 М розчином соляної кислоти, поступово доводячи середовище до значення рН 4,04,2. Далі проводили розділення твердої та рідкої фази за допомогою центрифугування протягом 30 хвилин при 5000 об/хв. З надосадової рідини, охолодженої до +5 °С, осаджували діючи речовини за допомогою 98 % оцтової кислоти при рН 4,0-4,2 та витримували при +5 °С протягом 24 годин. Осад відділяли центрифугуванням протягом 30 хвилин при 5000 об/хв, розчиняли у стерильному підлуженому фосфатному буфері рН 7,5-7,8 та проводили діаліз проти дистильованої води. Для глибокої очистки одержаного розчину алергену використовували широко відомий у біохімії метод гель-хроматографії з гелем сефадексом G-75. Гомогенність заповнення колонки гелем контролювали проходженням розчину високомолекулярного блакитного декстрану. Після промивання колонки одним об'ємом дистильованої води та двома об'ємами фосфатного буферного розчину рН 7,0 до неї вносили алерген. Початок збору 54687 6 фракцій в еліюючому розчині визначали методом спектрофотометрії при 280 нм. Препарат перевіряли відомими способами на стерильність та нешкідливість, визначали вміст одиниць білкового азоту. Стандартизували препарат у кожних діагностичних дозах. За 1 діагностичну дозу приймали розведення алергену з найменшим вмістом білкового азоту 400 PNU в 1 мл (0,00001 мг білкового азоту відповідає 1 PNU), яка викликає позитивні внутрішньошкіряні реакції у 4060 % хворих гвінейських мурчаків. Практично всі алергени елюювалися у складі фракції (молекулярна вага 15-300 кД), інші фракції були імунохімічно інертні або слабко активні. Одержаний розчин концентрували та піддавали ліофільній сушці. Отримали готовий продукт у вигляді сухої порошкоподібної речовини, легко розчинної у фосфатному-буфері або фізіологічному розчині. Приклад 2. Визначення алергодіагностичної дії препарату одержаного за заявленим способом, проводили на моделі генералізованого кандидозу у гвінейських мурчаків. Дослідження алергодіагностичної дії препарату проводили в умовах in vivo. Генералізований кандидоз викликали зависсю високовірулентного штаму Candida albicans ATTC 10231 у дозі, що у скрінінговому рівні при внутрішньочеревному зараженні закономірно обумовлює розвиток генералізованого кандидозу через 24-72 години. За об'ємом доза інфекту, використана для внутрішньочеревного зараження, становила 1 мл 18-20 годинних змивів агарових культур [4]. Перед інфікуванням мікробну суспензію стандартизували за оптичним стандартом каламутності на 10 ОД, виходячи з навантаження 1 млрд мікробних клітин на 1 мл. У досліді використовували гвінейських мурчаків середньою вагою 150-300 г. Алергодіагностичні властивості препарату, одержаного за заявленим способом, досліджували на 60 гвінейських мурчаках, відповідно поділених на дослідну та контрольну групи. У дослідної групи тварин з модельованою генералізованою кандидозною інфекцією алергодіагностування здійснювали шляхом одноразового введення препарату внутрішньошкірно у депільовану ділянку шкіри. Облік результатів проводили через 15-30 хвилин та через 24-48 годин. У заражених збудником кандидозу гвінейських мурчаків через добу виразно проявлялась гіперемія, підвищена температура шкіри у місці введення алергену та збільшення шкіряної складки на 2-4 мм, яка зберігалася не менше трьох діб. В інтактних тварин на місці введення алергенна реакція була відсутня. У порівнянні з незараженим контролем доведено, що застосування досліджуваного алергодіагностичного препарату забезпечує високий діагностичний ефект: - через 20-26 годин утворюється папула 8-15 мм у діаметрі та еритема 1420 мм. Як показали результати експерименту на тваринах, одержаний препарат не викликає хибнопозитивних реакцій у контрольної групи у дозі, яка виявляє гіперчутливість уповільненого типу у 100 % заражених тварин. 7 54687 Активність препарату, одержаного за заявленим способом, яку оцінювали за величиною його середньодозволяючої дози при алерготестуванні на тваринах, заражених гомогенним штамом гриба, складає 0,5 (0,35-0-,75) мкг білку на тварину масою 200 г. Ця доза викликає гіперчутливість уповільненого типу у 50 % тварин, заражених грибом роду Candida albicans штам АТТС 10231. Результати досліду свідчать про виражену алергодіагностичну дію препарату, одержаного за заявленим способом. Даний препарат може бути рекомендований для алергодіагностики кандидозної інфекції. Таким чином, заявлений новий спосіб одержання алергодіагностичного препарату кандидозної інфекції, який є раціональним, економічно обґрунтованим, відносно швидким і може бути відтворений на стандартному заводському обладнанні. Алергодіагностичний препарат, одержаний за заявленим способом, дозволяє ефективно та достовірно здійснювати алергодіагностику кандидозної інфекції. Джерела літератури Комп’ютерна верстка І.Скворцова 8 1. Anane S. and Khalfallah F. Biological diagnosis of systemic candidiasis: difficulties and future prospects //Pathologie Biologie. - 2007, - Vol. 55, № 5, - P. 262-272. 7 2. Пат. 2245721 Российская Федерация, МПК А 61 В 39/00, С 12 Р 21/00, 19/04, С 08 В 37/00, С 07 К 2/00, С 12 N 1/16//(С 12 N 1/16, С 12 R 1:725), (С 12 Р 21/00, С 12 R 1:645), (С 12 Р 19/04, С 12 R 1:645). Антигенные препараты /Дитер Фарнов, Иоахим Карле, Игорь Д. Поляков, Людмила Г. Иванова.; заявитель и патентообладатель БЕРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ВЕТМЕДИКА ГмбХ. - № 98104502/15, заявл. 09.08.1996; опубл. 10.02.2005, Бюл. № 4. 3. Агольцев В. А. Кандидоз, аспергелез и мукароз животных (диагностика и меры борьбы) //Автореф. дис. ... докт. ветер, наук. - Н. Новгород, ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (МГАВМиБ). - 2006. - 51 с. 4. Перший Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии - М.: Медицина, 1972, - 539 с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601