Імунологічний препарат для алергодіагностики кандидозної інфекції

Імунологічний препарат для алергодіагностики кандидозної інфекції на основі культури гриба 3 цього клітини розтираються у теплій воді при температурі 50 °С у ступці протягом 30-40 хвилин зі спиртовим розчином (3-нафтолу, який береться із розрахунку 0,5 частини на 1 частину клітин. Після чого проводять центрифугування, до фільтрату додається двократний об'єм 96° етилового спирту при подальшому підкисленні соляною кислотою до рН 4-5. Осад відділяється центрифугуванням, промивається спиртом та ефіром, а потім висушується. Після цього порошок розтирається у стерильній ступці та зберігається у рефрижераторі при 4-5° протягом кількох років [2]. Недоліком наведеного препарата є недостатньо глибока очистка від баластних речовин, що знижує активність препарата. Завданням корисної моделі є розробка імунологічного препарата для алергодіагностики кандидозної інфекції з високою активністю при імунодіагностиці кандидозів різної форми. Поставлене завдання вирішується таким чином, що імунологічний препарат для алергодіагностики кандидозної інфекції на основі культури гриба Candida albicans згідно з корисною моделлю містить внутрішньоклітинний матеріал, вивільнений сумарною дією на клітини гриба фізичних (ультразвукова дезінтеграція або механічне руйнування внаслідок перемішування) та хімічних (гідроксид натрію) чинників, очищений від баластних речовин стерилізуючою фільтрацією, переосадженням діючих речовин, діалізом та гельфільтрацією, стандартизований за вмістом білкового азоту із розрахунку 0,5 млг на одну діагностичну дозу препарату і виконаний у ліофілізованій формі. Заявлений препарат одержують наступним чином. Культури дріжджеподібного гриба роду Candida albicans висівають у пробірки з агаром Сабуро та культивують у термостаті при температурі 28 °С протягом 2-х діб. Одержану культуру змивають розчином натрію хлориду та висівають у матраци з агаром Сабуро. Далі проводять культивування у термостаті при температурі 28 °С протягом 10-18 діб. Через 5-6 діб культуру з кожного матрацу перевіряють на чистоту шляхом мікроскопування. Одержану культуру змивають розчином натрію хлориду. Клітини гриба відділяють від розчину натрію хлориду центрифугуванням протягом 30 хвилин при 5000-6000 об/хв. Отриманий осад - біомасу грибів Candida albicans висушують і використовують для одержання діючих речовин шляхом руйнування клітин та вивільнення внутрішньоклітинного матеріалу. Руйнування клітин збудника кандидозу проводять за допомогою фізико-хімічних методів. Це обумовлено будовою клітини гриба, передусім його оболонки, яка суттєво відрізняється від оболонки бактерій, а також з особливостями її хімічного складу. Для цього використовують ультразвукову дезинтеграцію клітин гриба або механічну - шляхом інтенсивного перемішування у поєднанні з хімічним агентом гідроксидом натрію. Подрібнену біомасу грибів обробляють 3-5 % водним розчином гідроксиду натрію у поєднанні з ультразвуковою дезінтеграцією при довженні хвилі 20-24 кГц та інтенсивності 5-100 Вт/см2 протягом 54688 4 15-90 хвилин при температурі не вище 30 °С або при постійному перемішуванні за допомогою мішалки зі швидкістю обертання 1000-1500 об/хв. при температурі не вище 50-60°С. Швидкість обертання мішалки 1000-1500 об/хв. є оптимальною величиною, яка забезпечує раціональне використання електроенергії та руйнування клітин гриба. Збільшення кількості обертів затрачує більше електроенергії та не забезпечує пропорційного прискорення руйнування клітин, а навіть може призвести до утворення "мертвих зон". Зменшення кількості обертів призводить до уповільнення руйнування клітин гриба, а електроенергія затрачується майже так само. Звільнення від зруйнованих та незруйнованих вегетативних та спорових клітин проводять методом стерилізуючої фільтрації на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,45 мкм та 0,22 мкм. Одержаний фільтрат містить алергени, його обробляють 0,5-1,0 М розчином органічної або 0,1-1,0 М розчином мінеральної кислоти, поступово доводячи рН середовища до значення 4,04,2. Далі проводять розділення твердої та рідкої фази за допомогою центрифугування. З надосадової рідини осаджують 98 % оцтовою кислотою діючи речовини, розчиняють у підлуженому фосфатному буфері рН 7,2-7,8, проводять діаліз проти дистильованої води та піддають гельхроматографії на колонках з сефадексом G-75 або молселектом. Фракції, очищені від імунологічно інертного баласту, елюються під контролем спектрофотометрії при 280 нм у вигляді першого піку, відповідно вільному об'єму гелю. Цільовий продукт виділяють у діапазоні 15-300 кД. Після перевірки стерильності та нешкідливості одержаний препарат стандартизують за вмістом білкового азоту (із розрахунку 0,5 млг на одну діагностичну дозу препарату) та піддають ліофільній сушці. Одержують суху порошкоподібну речовину, легко розчинну у фосфатному буфері або фізіологічному розчині. Заявлений алергодіагностичний препарат містить білки та полісахариди, які представлені складними полімерними структурами і частково вільними мономерами. Полісахариди представлені моносахаридними елементами: занозою, у меншій кількості глюкозою, галактозою, ксілозою. Таким чином, заявлений алергодіагностичний препарат містить у своєму складі всі діючи речовини, необхідні для забезпечення високої активності, і виключає необхідність створення комплексних препаратів. Новий імунологічний препарат для алергодіагностики кандидозної інфекції може бути використаний безпосередньо або у інших лікарських формах: ліофілізованій, розчину для ін'єкцій, може використовуватися для створення діагностичного пластиру тощо. Одержаний препарат уявляє собою безбарвну кристалічну речовину розчинну у гіпертонічному розчині натрію хлориду та фосфатному буфері. Заявлений препарат вивчений на наявність імунологічної алергодіагностичної дії та гострої токсичності. Всі ознаки заявленого препарата визначені експериментальним шляхом і забезпечують доціль 5 54688 ність використання імунологічного препарата для алергодіагностики кандидозної інфекції. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. Визначення алергодіагностичної дії заявленого препарата проводили на моделі генералізованного кандидозу у гвінейських мурчаків. Дослідження алергодіагностичної дії препарата проводили в умовах in vivo на моделі генералізованого кандидоза, яку викликали зависсю високовірулентного штаму Candida albicans ATTC 10231 у дозі, що у скрінінговому рівні при внутрішньочеревному зараженні закономірно обумовлює розвиток генералізованного кандидозу через 24-72 години. За об'ємом доза інфекту, використана для внутрішньобрюшинного зараження, становила 1 мл 18-20 годинних змивів агарових культур [3]. Перед інфікуванням мікробну суспензію стандартизували за оптичним стандартом мутності на 10 ОД, виходячи з навантаження 1 млрд мікробних клітин на 1 мл. У досліді використовували гвінейських мурчаків середньою вагою 200-350 г. Алергодіагностичні властивості препарата досліджували у по груповому використанні тварин на інфекційну модель 60 гвінейських свинок, відповідно поділених на дослідну та контрольну підгрупи. У дослідної групи тварин з модельованою генералізованою кандидозною інфекцією алергодіагностування здійснювали шляхом одноразового введення препарату внутрішньошкірно у депільовану ділянку шкіри. Облік результатів проводили через 15-30 хвилин та через 24-48 годин. У заражених збудником кандидозу гвінейських мурчаків через добу виразно проявлялась гіперемія, підвищена температура шкіри у місті введення алергену та збільшення шкіряної складки на 2-4 мм, яка зберігалася не менше Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 6 трьох діб. В інтактних тваринах на місті введення алергенна реакція була відсутня. У порівнянні з не зараженим контролем доведено, що застосування досліджуваного діагностичного препарата забезпечує значний діагностичний ефект - через 20-26 годин утворюється папула 8-15 мм у діаметрі та еритема 14-20 мм. Як показали результати експерименту на тваринах, одержаний препарат не викликає ложнопозитивних реакцій у контрольної групи у дозі, яка виявляє гіперчутливість уповільненого типу у 100 % заражених тварин. Специфічна активність заявленого препарата, яку оцінювали за величиною його середнєдозволяючої дози при алерготестуванні на тваринах, заражених гомогенним штамом гриба, складає 0,5 (0,35-0-,75) мкг білку на тварину масою 200 г. Ця доза викликає гіперчутливість уповільненого типу у 50 % тварин, заражених грибом роду Candida albicans штам АТТС 10231. Таким чином, заявлений новий імунологічний препарат для алергодіагностики кандидозної інфекції, який має високу активність та низьку реактогенність і дозволяє ефективно та достовірно здійснювати алергодіагаостику кандидозної інфекції. Джерела літератури 1. Anane S. and Khalfallah F. Biological diagnosis of systemic candidiasis: difficulties and future prospects //Pathologie Biologie. - 2007, - Vol. 55, № 5, - P. 262-272. 2. Кашкин П.Н., Елинов Н.П., Дроздов А.И. Антигены для серологических реакций и аллергических проб при грибковых заболеваниях - Ленинград, 1959, - 20 с. 3. Перший Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии - М.: Медицина, 1972, - 539 с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601