Спосіб експериментального моделювання дозованого ушкодження зорового нерва

Спосіб експериментального моделювання дозованого ушкодження зорового нерва, який відрізняється тим, що стандартизація експериментальної моделі ураження зорового нерва досягається шляхом введення метанолу в систему передньої порожнистої вени Винахід відноситься до експериментальної офтальмології і може бути використаним при вивченні механізмів ушкодження зорового нерва, а також для випробування нових фармакологічних і біологічно активних препаратів Пошкодження органа зору в ЗО - 60% спостережень призводять до одно-, або двобічної сліпоти У багатьох випадках патологічний процес у пошкодженому оці призводить до таких змін очного яблука, що збережений в ньому зір не перевищує 10% (Абрамов В Г Основные заболевания глаз в детском возрасте и их клинические особенности - М Мобиле, 1993 - 495с, Либман Е С , Шахова Е В Состояние и динамика слепоты и инвалидности вследствие патологии органа зрения в России // Труды VII съезда офтальмологов России - 4 2 - Москва, 2000 - С 209 - 214), що потребує розробки і стандартизованого експериментального визначення ефективності нових офтальмологічних препаратів при різноманітній патологи ока, в тому числі й при ураженні очного нерва (ЕР 918538 А1 Stauder G , Ransberger К Способ применения протеолитических ферментов для лечения увеита - Изобретения стран мира - 2000 - Вып8, №11 - С 14, JP 2854631 В2 3161444 А Inoune Atsushi Ингибитор реакции Мейяра (Maillard) - Изобретения стран мира - 1999 Вып8, №5 - С 18, ЕР 879601 А2 Mackeen DL Система доставки глазного лекарства - Изобретения стран мира - 1999 - Вып 8, №22 - С 9, DE 19742717 Al Muenter К Фармацевтические комбинированные препараты - Изобретения стран мира - 2000 - Вып 8, №7 - С 2) Мета винаходу Розробити спосіб дозованого ураження зорового нерва для експериментального дослідження ефективності нових фармакологічних препаратів та інших фармако-бюлопчних засобів лікування в офтальмології Поставлена мета досягається тим, що метанол вводиться в крайову вену вуха, що забезпечує швидке венозне повернення крові до серця через систему передньої порожнистої вени з мінімальним розповсюдженням метилового спирту по внутрішніх органах тварини Результати експериментальних досліджень У роботі використано 15 кроликів породи Шиншила (маса тіла 3,0 - 3,2кг) Моделювання ураження зорового нерва проводили у 10 кроликів шляхом внутрішньовенного (в крайову вену) вуха або внутрішньочеревного введення метилового спирту в дозі 1,8г на кг маси тіла, розводячи метанол 0,9% розчином натрію хлориду ВДВІЧІ Контрольну групу склали 5 здорових кроликів Останніми роками в КЛІНІЧНІЙ офтальмології широко застосовуються електрофізіологічні методи дослідження, зокрема електроретинографія, як об'єктивний метод дослідження функціонального стану нейронального апарату ока (Зислина Н Н , Шамшинова А М Физиологические основы и возможности использования зрительных вызванных потенциалов в дифференциальной диагностике глазных болезней // Клиническая физиология зрения -М Руссомед -1993 -С 146-157) Чисельні дослідження засвідчують, що застосування цієї методики в КЛІНІЦІ сприяє більш ЯКІСНІЙ діагностиці, дозволяє визначити рівень ураження і оцінити динаміку патологічного процесу та ефективність лі со о (О ю 56039 кування (Катаргина Л А , Шамшинова А М , Орловская Л С Функциональное состояние сетчатки у детей с увеитами и постувеальными осложнениями // Патология глазного дна и зрительного нерва - М МНИИГБ им Гельмгольца -1991 - С 58 - 68 Шамшинова А М Электрофизиологические методы исследования в диагностике заболеваний органа зрения у детей и оценка их реабилитации // Функциональная реабилитация в офтальмологии - М МНИИГБ им Гельмгольца - 1990 - С 122 127) Електроретинографія уявляє собою метод реєстрації багатофазової біоелектричної реакції клітинних елементів СІТКІВКИ, що виникає внаслідок дії світлового подразника Загальна електроретинограма відображає електричну активність більшості клітинних елементів СІТКІВКИ, що залежить від КІЛЬКОСТІ здорових функціонуючих клітин В сучасній КЛІНІЧНІЙ офтальмології найчастіше використовують загальну (ганц-фельд), локальну (макулярну), ритмічну та патернелектроретинографію (Шамшинова А М Электроретинография в клинике глазных болезней // Клиническая физиология зрения - М Руссомед 1993 -С 5 7 - 8 2 ) Загальна ретинограма - сумарний біоелектричний потенціал, що реєструється у ВІДПОВІДЬ на засвіт всієї площини СІТКІВКИ (ганц-фельд - все поле) Він реєструється між активним електродом на рогівці та референтним електродом на мочці вуха Обов'язково використовують третій, заземлюючий електрод Частіше в якості активного використовують електрод-присоску у вигляді пустотілої напівсфери, з матовим переднім склом, що забезпечує рівномірний засвіт усієї площі СІТКІВКИ В якості стимулятора частіше застосовують імпульсну лампу-спалах, що генерує імпульс білого світла тривалістю не більше 5мс та інтервалом інтенсивностей на поверхні рогівки 1,5 - 3,0кд/м2 (Даниличев В Ф Современная офтальмология руководство для врачей - СПб Питер, 2000 672с) Враховуючи малі амплітудні значення реєструємих параметрів, для отримання достовірних результатів необхідно використовувати підсилювачі біопотенціалів Для запису сигналу можуть бути використані як чорнильнопишучі пристрої (типу енцефалографа) так і осцилографи Сучасні досягнення комп'ютерних технологій дозволяють поєднати та значно спростити реєстрацію та аналіз отриманих даних (Шамшинова А М , Нестерюк Л И , Ендриховский С Н Возможности компьютерной обработки результатов исследования зрительной системы//Вести, офтальмол -1992 -Т108, №2 -С 2 9 - 3 5 ) У загальній ЕРГ в нормі виділяють слідуючі компоненти негативну "а " - хвилю, позитивні "Ь", "с" та "d" - хвилі Останні дві хвилі реєструються лише за певних умов стимуляції та реєстрації Кожну з хвиль характеризують два параметри амплітуда хвилі (в мікровольтах) та час хвилі (в мілісекундах) Хвиля а відображає функцію фоторецепторів Вона переходить в позитивну Ь-хвилю, або on-ефект, що характеризує електричну активність біполярів та клітин Мюллера (гліальна популяція) з можливим внеском горизонтальних та амакринових клітин По закінченні дії стимулу (вимкнення світла) реєструється d-хвиля (off-ефект) 4 Ця остання фаза електроретинограми є результатом взаємодії а-хвилі та компонента постійного струму а-хвилі Генерація потенціалів СІТКІВКОЮ починається з виходу К+ з ретинальних нейронів (деполяризація) в МІЖКЛІТИННИЙ простір у ВІДПОВІДЬ на включення світла Мембрана клітин Мюлера, яка проникна для К+, локально деполяризується і є основним джерелом генерації b-хвилі Біоелектрична активність розповсюджується від зовнішнього ядерного шару до поверхні СІТКІВКИ І корелює з КІЛЬКІСТЮ нейронів в дистальному та проксимальному відділах СІТКІВКИ Хвиля с (повільне позитивне відхилення) може реєструватись лише за використання безперервних стимулів високої Інтенсивності та великої тривалості в темно адаптованому оці Труднощі виділення цієї хвилі пов'язані також з дрейфом базової лінії (Шамшинова А М , Волков В В Функциональные методы исследования в офтальмологии -М Медицина, 1998 -416с) ВІДПОВІДНО ДО існуючих стандартів амплітуду а-хвилі оцінюють від базової лінії до піка, амплітуду й-хвилі вимірюють від піка хвилі а до піка хвилі Ь, а час Ь-хвилі (implicit time) вимірюється від часу спалаху до піка цієї хвилі До початку зниження амплітуди Ь-хвилі, патологічних процесів у фоторецепторах СІТКІВКИ спостерігається збільшення implicit time Дослідження загальної ЕРГ необхідно проводити у всіх випадках пошкодження ока, особливо коли наявні зміни в рогівці, кришталику, скловидному ТІЛІ для оцінки функціонального стану СІТКІВКИ та прогнозування можливих виходів травм та оперативних втручань Проведення електроретинографії при очному травматизмі - найбільш точний спосіб контролю за ефективністю консервативного та хірургічного лікування, що проводиться (Шамшинова А М , Яковлев А А Оценка функций сетчатки при катаракте с помощью электроретинографии // Вести, офтальмол - 1991 - Т107, №1 С 36 - 42 ) Таким чином, порушення нормального фізіологічного стану СІТКІВКИ визначають зміни часових та/або амплітудних параметрів електроретинограми До цих факторів відносять стан хорюїдальної та ретинальної циркуляції, пігментного епітелію, колбочок та паличок, біполярних, горизонтальних та амакринових клітин, стан зовнішнього та внутрішнього синаптичних шарів При захворюваннях СІТКІВКИ зміни електроретинограми можуть виникати раніше КЛІНІЧНИХ проявів (Миронова Э М , Егорова Э В , Куман Н Г и др Электрофизиологическая диагностика и патогенез макулярного отека // Офтальмол журн - 1987 - №1 - С 21 - 24 Шамшинова А М , Смольянинова И Л , Мац К А и др Роль биопотенциалов сетчатки в изучении механизмов возникновения нистагма // Вести, офтальмол -1991 -Т 107, №6 -С 46-51 ) Міжнародне товариство КЛІНІЧНИХ електрофізіологіє зору радить проводити електрофізіологічні дослідження для оцінки функції СІТКІВКИ та зорового нерву при травмі, при сидерозі, відшаруванні СІТКІВКИ, ішемії СІТКІВКИ, симпатичній офтальмії, ендофтальміті (Kondo М , Miyake Y , Hiroguchi M et al Clinical evaluation of multifocal electroretinogram// 56039 Invest Ophmalmol Vis Sci -1995 - V 36, №10 -P 2146-2151 ) Ми визначали стан нейрорецепторів (біопотенціали ЗОВНІШНІХ і внутрішніх шарів СІТКІВКИ) методом загальної електроретинографії на комп'ютеризованій системі запису електроретинограм з фотостимулятором "ФС-03" ("Медап", Україна) за допомогою електрода, що накладали на око по лімбу Характерною рисою конструкції даного електрода є наявність площинного переднього віконця, що дозволяє бачити стимули СВІТЛОВІ стимули формували фотостимулятором "ФС-03" із лампоюспалахом Використовувана частота стимулів - 1 Гц, яскравість стимулів - 25Кд/м Колір стимулів білий Функцію зорового аналізатора оцінювали за амплітудою хвиль а і b Електроретинографію проводили на першу, третю, сьому, чотирнадцяту і тридцяту доби після моделювання ушкодження зорового нерва За результатами наших досліджень, на електроретинографічні параметри суттєво впливає шлях введення метанолу внутрішньовенне введення метилового спирту викликало зміну нормального типу електроретинограми на супернормальний, що характеризує ушкодження гальмівних нейронів зорового нерва (табл 1), тоді як при введенні тієї самої дози в черевну порожнину в тварин спостерігається субнормальный тип електроретинограми (табл 2), який є більш характерним для ураження нейронів СІТКІВКИ Варто зазначити, що в основі класифікації електроретинограм лежать амплітудні характеристики основних а- та b-хвиль Розрізняють наступні види електроретинограм нормальну, супернормальну, субнормальну (плюс- та мінус-негативну), нереєстровану (відсутню) Субнормальна електроретинограма - найбільш частий вид, який характеризується зниженням амплітуди а- та b-хвиль її реєструють при дистрофічних захворюваннях СІТКІВКИ та хорюїдеї, відшаруванні СІТКІВКИ, увеїтах із залученням в процес 1 - 2 нейронів СІТКІВКИ, хронічній судинній недостатності з порушенням мікроциркуляцм Негативній електроретинограмі притаманне збільшення або збереження амплітуди ахвилі та невелике (до ІЗОЛІНІЇ - плюс-негативна) чи значне зниження (нижче ІЗОЛІНІЇ - мінус-негативна) амплітуди Ь-хвилі Негативна електроретинограма спостерігається при дисфункції дистального фото 6 рецепторного шару Ступінь негативізацм хвилі b може бути різним - від малоамплітудної до нереєстрованої Ь-хвилі Мінус негативна електроретинограма зустрічається при гострих порушеннях кровообігу в СІТКІВЦІ Нереєстрована (відсутня) електроретинограма є електрофізіологічним симптомом важких незворотніх змін в СІТКІВЦІ при розвинутому металозі, запальних та травматичних процесах в оболонках ока, тотальному відшаруванні сітчастої оболонки ока, оклюзм центральної артерії СІТКІВКИ та ш Супернормальна електроретинограма характеризується збільшенням амплітуди а- та Ь-хвиль, що є наслідком подразнення фоторецепторів СІТКІВКИ, яке може спостерігатись при перших ознаках гіпоксії, медикаментозних штоксикаціях, в початковому періоді симпатичної офтальмії, металозів ока, при ураженні зорового нерва (пошкодження центробіжних гальмуючих волокон) (Пономарчук В С , Дмитриев С К Электрофизиологическая характеристика функционального состояния сетчатки при различных стадиях металлоза // Офтальмол журн -1999 - №6 -С 379-383) ВИСНОВОК Об'єктивні дані електроретинографії засвідчують, що внутрішньовенне введення метанолу кроликам викликає дозоване ураження зорового нерва, що може бути використано в експериментальній офтальмології для стандартизації результатів дослідження ВІДПОВІДНІСТЬ критерію "новизна" даного способу забезпечує те, що для об'єктивізації результатів експериментального визначення ефективності нових фармакологічних та інших біологічно активних офтальмологічних засобів проводиться дозоване і контрольоване електроретинографічно ураження зорового нерва ВІДПОВІДНІСТЬ критерію "суттєві ВІДМІННОСТІ" да ного способу забезпечує те, що на відміну від відомих раніше способів моделювання ураження зорового нерва стандартизація досягається шляхом введення метанолу в систему передньої порожнистої вени ВІДПОВІДНІСТЬ даного винаходу критерію "позитивний ефект" забезпечується результатами експериментальних досліджень, які об'єктивно (електроретинографія) засвідчують факт дозованого ураження зорового нерва при використанні запропонованого способу Таблиця 1 Вплив внутрішньовенного введення метанолу на електроретинографічні характеристики функції зорового аналізатора у кроликів (х ± Sx) Період досліду 1-ша доба Контроль, п = 5 -15,85 ±1,03 -32,06±4,12 р