Спосіб одержання окремих фракцій пептидного екстракту підшлункової залози, які мають специфічну дію

Спосіб одержання окремих фракцій пептидного екстракту підшлункової залози, що включає оц Винахід стосується галузей біологи, медицини та може бути використаний у біотехнологм і фармації для добування біологічно активних речовин (БАР) пептидної природи з підшлункової залози Інтерес до регуляторних пептидів з кожним роком набуває нових ВІДТІНКІВ та розповсюджується на величезне поле від генної інженери до лабораторного та КЛІНІЧНОГО вивчення БІОЛОГІЧНО активні речовини поліпептидної природи, які виділені із множини органів та тканин, мають виражену модулюючу органоспецифічну дію на стан систем регуляції як в ураженому органі так і в цілісному організмі Екстракти пептидів володіють наступною ефекторною направленістю дія на орган, із якого поліпептидна речовина виділена, дія на фізіологічне корелюючий орган, неспецифічна дія на організм в цілому [Кайдашев И П Сравнительное изучение хроматографических спектров полипептидов, экстрагированных из селезенки, печени, почек, тимуса и парадонта свиней // Укр биохим журн - 1995 - т 67, №5 - С 85-89 , Полежаев Л В Очерки о биологически активных веществах // Успехи соврем, биол -1992 -112, вып 1 - С 74-87 ] ВІДОМІ способи одержання поліпептидних препаратів препарат, який містить комплекс пептидів з молекулярною масою до ЮкД, одержаний методом кислотної екстракції (3% розчин оцтової кислоти) тканин кільчастих червів Eisema foetida (у співвідношенні 1 10) в присутності 0,1% розчину хлориду цинку та 0,1% розчину хлориду магнію Препарат не шкідливий, має виражені ексудативні, антиоксидантні, репаративні та колагенотропні властивості, сприяє відновленню нормальної стру ктури сполучної тканини, що забезпечує терапевтичний ефект при порушенні метаболізму сполучної тканини [Патент України 5443 С1 А61К37/02 Препарат тканинних біологічно-активних речовин, який має регуляторну дію, та спосіб його одержання Кайдашев І П , Катрушов О В , Цебржинський 0 І , Чумаков О В , Лисенко С В , Закладний В П , Сухотинський В Л Заяв 29 06 93 Опубл 29 12 94 Бюл №8-1 ] Також відомий спосіб одержання біологічно активної речовини для лікування захворювань серця, який включає знежирення та зневоднення подрібненої тканини серця великої рогатої худоби або свиней в органічному розчиннику, екстракцію 1-5% трихлороцтовою кислотою в присутності 0,1% розчину хлориду цинку та 0,1% розчину хлориду магнію, преципітацію фільтрату органічним розчинником та люфілізацію препарату [Деклараційний патент України 28342А, 5А61К31/00 Спосіб одержання біологічно активної речовини для лікування серцевих захворювань Кайдашев 1 П , Катрушов О В , Куценко Л О , Павленко Г П Заяв 0108 96 Опубл 29 12 99 Бюл №8, 16 10 2000 Бюл №5-11] Найбільш близьким до винаходу є спосіб отримання пептидного екстракту підшлункової залози [Патент Укриши 10281 Спосіб отримання речовини для лікування захворювань підшлункової залози Скрипніков М С , Кайдашев І П , Лігоненко О В, Катрушов О В Заяв №94042070 Опубл 15 112000 Бюл №6], який включає обезводнення подрібненого тканевого матеріалу (підшлункова залоза свиней) в органічному розчиннику, кислот 00 ю 58144 ну екстракцію (0,5% розчин трихлороцтової кислоти) в присутності 0,1% розчину хлоридів цинку та магнію, фільтрацію реакційної суміші, осадження із фільтрату органічним розчинником, обробку одержаного осаду ефіром з наступним розчиненням його в дистильованій воді та люфілізацію препарату Однак, ВІДОМІ способи не дають можливості отримати речовини з специфічними (індивідуальними) властивостями, які цілеспрямовано діяли б на окремий ланцюг системи регуляції як в ураженому органі, так і в цілісному організмі В основу винаходу поставлене завдання створити спосіб одержання окремих фракцій пептидного екстракту підшлункової залози, які мають специфічну дію шляхом удосконалення відомого способу досягти отримання речовин із специфічними властивостями та забезпечити їх цілеспрямовану дію на окремі ланцюги системи регуляції Поставлене завдання вирішують шляхом додаткового розділення отриманого пептидного екстракту за допомогою іонообмінної хроматографії Спосіб здійснюється наступним чином 1) отримують екстракт підшлункової залози, 2) проводять іонообмінну хроматограму Пептидний екстракт підшлункової залози отримують з тканини підшлункової залози великої рогатої худоби та свиней, яку подрібнюють до розмірів 2х2х2мм, заливають одержану масу холодним (+ 4°С) ацетоном (особливо чистим) у співвідношенні 1 8 Після 48 годин витримки ацетон зливають, масу ,що залишилась висушують Після ЦЬОГО її змішують у співвідношенні 1 10 з 0,5% розчином трихлороцтової кислоти (з 0,1% розчину хлориду цинку та 0,1% розчину хлориду магнію) та на протязі 72 годин постійно перемішують при +4°С Рідку частину суміші після фільтрації через полотно та фільтри (0,2мм) змішують з ацетоном у співвідношенні 1 10, витримують 48 годин при +4°С Дисперсну частину відмивають ацетоном та ефіром у співвідношенні 1 10 та висушують Одержану речовину розчиня ють в дистильованій воді (рН 4,5) у співвідношенні 1 Юта люфілізують Для проведення хроматографії використовують юнообмінник -DEAE-TOYOREARL 650 ("ТОYOSODA", Японія) - середньо сильний аніоніт, розмір частинок 44-88цм Режим роботи колонки швидкість 150 мл/год, об'єм проби 2,5 мл Елюенти Нульова концентрація NaCI - 10 хвилин - трисбуфер рН=8 0,05% -10 хвилин -0.05М NaCI 0,1% -10 хвилин -0,1М NaCI 0,15% -10 хвилин - 0.15М NaCI 0,2% -10 хвилин -0,2М NaCI 0,3% -10 хвилин -0,ЗМ NaCI 0,5% -10 хвилин -0,5М NaCI 0,75% -10 хвилин - 0.75М NaCI 1,0% -10 хвилин - 1,0М NaCI Пробу пептидного екстракту підшлункової залози для внесення в колонку готують так наважку 25мг ПЕПЗ розчиняють в Змл трис-буфера рН 8,0 Старанно перемішують, витримують 15хв при кімнатній температурі та центрифугують протягом 15хв при 3000об/хв Надосадову рідину переносять в окрему пробірку та за допомогою шприца вносять через петлю насосу в хроматографічну колонку В ХІМІЧНІ пробірки, які знаходяться на колекторі, відбирають проби фракцій Відібрані проби фракцій (100) підлягали спектрофотометри при 280нм За показниками екстинцм будують графік, який вказав на наявність ПІКІВ (ФІГ 1) Кожен пік являв фракцію пептидного екстракту Об'єм всіх проб, які входили до фракції, заміряють, визначають вміст білку в кожній фракції по Лоурі Найбільша концентрація білку (0,137мг/мл) в першій фракції, а найменша (0,012мг/мл) - в проміжних фракціях, що виходять між піками Таблиця 1 Вміст білку у фракціях пептидного екстракту підшлункової залози Назва фракцій І фракція ПЕПЗ II фракція ПЕПЗ III фракція ПЕПЗ IV фракція ПЕПЗ V фракція ПЕПЗ 0 фракція ПЕПЗ Вміст білку мг/кг 0,137+0,0457 0,072+0,0328 0,041+0,0018 0,018+0,0059 0,015+0,0037 0,012+0,0018 Після визначення білку в розчинах фракцій пептидного екстракту підшлункової залози, доводять рН середовища льодяною оцтовою кислотою до 2,8-3,0 Охолодженим ацетоном у співвідношенні 8 1 проводять стадію преципітації, та витримують розчини 1 добу в морозильній камері Після ЦЬОГО, розчини підлягають центрифугуванню на протязі 10 хвилин при 3000об/хв Отримані осади промивають охолодженим ацетоном та висушують на повітрі при кімнатній температурі Отже, пептидний екстракт при даних умовах розділення, має 5 фракцій Вивчення фізіологічної активності окремих фракцій пептидного екстракту підшлункової залози За час проведення експерименту були відсутні смертність тварин, зміни у зовнішньому вигляді тварин та їх поведінці Аналіз даних вказав на коливання вмісту глюкози в сироватці крові в межах значень інтактних тварин після введення пептидних фракцій Істотних змін коефіцієнту маси підшлункової залози та тимусу не відмічалося Цифровий матеріал не відображав вірогідності Таким чином, фракції ПЕПЗ не впливали на коефіцієнти мас досліджуваних органів та на вміст глюкози в сироватці крові тварин При гістологічному дослідженні тканин підшлункової залози інтактних тварин острівці Лангерганса мали овальну форму, ЧІТКІ контури з незначною КІЛЬКІСТЮ сполучнотканинних перегородок та рівномірним розподіленням капілярів Чітко дифе 5 58144 ренціювалися різні типи клітин Основну масу острівців складали р-клітини (74,9%), при чому зрілі (дефінітивні) клітини розміщувалися по периметру острівців Незрілі інсулярні (ацидофільні та базофільні) клітини займали основну площу острівців з окремими включеннями зрілих р клітин Спостерігалося дифузне розподілення а клітин (їх склад становив 25,1%) Співвідношення р- клітин до а - клітин складало 2,98 Екзокринна частина залози навколо острівців характеризувалася рівномірним розподіленням окремих клітин При гістологічному дослідженні тканин підшлункової залози тварин, яким вводили ін'єкційну воду в об'ємі 0,5 мл на кожну тварину протягом 10 днів, острівці Лангерганса мали ЧІТКІ контури, розмір не відрізнявся від тварин інтактної групи Гістологічне дослідження тканин підшлункової залози тварин, яким вводили не розділений пептидний екстракт підшлункової залози вказало на зменшення розмірів острівців Лангерганса в 1,56 рази порівняно з інтактними тваринами Спостерігалася тенденція до зменшення дефінітивних клітин р - клітини складали 45,8%, а-клітини 54,2% За рахунок зменшення як абсолютної, так і відносної КІЛЬКОСТІ р -клітин, коефіцієнт співвідношення р а знизився до 0,85 Відмічалась гіпертрофія екзокринних клітин з максимальним вмістом секрету, що призводило до зникнення секретуючих клітин, при цьому клітини розташовувались дуже тісно одна до одної Гістологічне дослідження тканин підшлункової залози тварин, яким вводили фракцію І пептидного екстракту підшлункової залози виявило збільшення об'єму острівців (2,14) приближено до показників тварин інтактної групи (2,45) Різко збільшилася КІЛЬКІСТЬ р - клітин (в 1,6 раза порівняно в введенням ПЕПЗ), особливо дефінітивних клітин КІЛЬКІСТЬ а-клітин зменшилась в 2 рази в цьому ж порівнянні, але не досягала показників інтактних тварин Коефіцієнт співвідношення р а становив 3,0 Клітини екзокринної частини залози виражені навколо острівців, на периферії - різко зменшені в розмірі При гістологічному дослідженні тканин підшлункової залози тварин, яким вводили фракцію II пептидного екстракту підшлункової залози спостерігалось зменшення розмірів острівців Лангерганса, зникнення чітких контурів та появою ділянок просвітлення без клітин, що може свідчити про набряк тканини КІЛЬКІСТЬ р- клітин (64,0) була зменшені в 2,4 рази порівняно з показниками інтактних тварин, але значно перевищувала показники тварин, яким вводили ПЕПЗ Різко зменшилася КІЛЬКІСТЬ а - клітин (8,0) у порівнянні як з показниками інтактних тварин, ПЕПЗ, фракцією І Співвідношення р а становив 8 В екзокринній частині залози спостерігались ділянки спустошення Гістологічне дослідження тканин підшлункової залози тварин, яким вводили фракцію III пептидного екстракту підшлункової залози вказало на незначне зменшення розмірів острівців Лангерганса порівняно з інтактними тваринами Відмічалося 6 зменшення р- клітин (34,0) Спостерігалися поодиноко розташовані а - клітини В порівнянні з II фракцією, яка мала максимальний інгібуючий вплив на цей показник, фракція III позитивно впливала на а - клітини, що проявилося в зростанні їх КІЛЬКОСТІ (12,0) Коефіцієнт співвідношення р а нормалізувався і становив 2,83 Екзокринна частина залози практично не відрізнялася від інтактних тварин При гістологічному дослідженні тканин підшлункової залози тварин, яким вводили фракцію IV пептидного екстракту підшлункової залози спостерігався ріст розмірів острівців Лангерганса, який наближався до показників інтактних тварин Спостерігалася тенденція до зростання абсолютного числа р- клітин (39,0) з перевагою зрілих форм Аналогічна картина мала місце по відношенню до а - клітин (49,0) Коефіцієнт співвідношення р а становив 0,8 (аналогічний при введенні ПЕПЗ) В острівцях Лангерганса спостерігалися порожнини з відсутністю ацидофільних та базофільних інсулярних клітин, що нагадували картину морфологічної структури залози при введенні фракції II Екзокринна частина залози не відрізнялася від інтактних тварин При гістологічному дослідженні тканин підшлункової залози тварин, яким вводили тімалін спостерігалося різке зменшення площі острівців Лангерганса (як при дії ПЕПЗ) КІЛЬКІСТЬ р- клітин зменшилась в 5 разів, а - клітин - зменшилась в 2 рази порівняно з інтактними Коефіцієнт співвідношення р а клітин становив 1,6 Морфологічна картина екзокринної частини залози не відрізнялася від інтактних тварин Таким чином, результати ГІСТОЛОГІЧНИХ досліджень вказали 1 Пептид ний екстракт підшлункової залози проявляв активність по відношенню до ендокринної частини острівців за рахунок дії на р - клітини 2 Фракція І ПЕПЗ відображала різноспрямовану дію на а - та р-клітини сприяла збільшенню відносної КІЛЬКОСТІ р - клітини та зменшенню а - клітин 3 Фракція II ПЕПЗ виявляла тропність до обох типів клітин підшлункової залози, але відрізнялась більш вираженим впливом на а - клітини 4 Фракція III ПЕПЗ призводила до рівномірного зменшення розмірів ендокринної частини залози зі збереженням співвідношення р а в острівцях 5 Фракція IV ПЕПЗ сприяла збільшенню площі острівців підшлункової залози за рахунок а - клітин 6 Дія тималіна полягала в зниженні функції залози за рахунок впливу на р - клітини, що призвело до переваги чисельності а - клітин Отже, фракції І та IV ПЕПЗ є найбільш біологічно активними, характерною ознакою, яких є вплив на ендокринну частину підшлункової залози, і тому їх можна вважати перспективними для подальшого вивчення 58144 Комп'ютерна верстка Л Ціхановська Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна