Спосіб діагностики реплікативних безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції у віл-інфікованих жінок репродуктивного віку, вагітних та новонароджених дітей

Спосіб діагностики реплікативних безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції у ВІЛ 3 ня плоду. Серологічна діагностика активних форм ЦМВІ у них ускладнюється зниженням синтезу імуноглобулінів класів IgM [1, 2]. Верифікація діагнозу активної ЦМВІ має вирішальне значення на етап планування вагітності. Вона дозволяє скорегувати терапевтичні заходи провести адекватну прегравідарну підготовку, яка забезпечить контроль імунної системи над вірусом під час гестаційного періоду і дозволить зберегти здоров'я майбутній дитині. Згідно з протоколом діагностики ЦМВІ, постановка діагнозу і встановлення клінічної форми захворювання ґрунтується на комплексному лабораторному обстеженні - визначенні противірусних антитіл методом імуноферментного аналізу (ІФА) та ДНК вірусу методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у крові та інших біологічних рідинах [8, 10, 12]. Особливістю ЦМВІ є персистенція збудника в організмі упродовж всього життя, доказом якої є наявність специфічних IgG. Однак, виявлення анти-ЦМВ IgG при серологічному дослідженні не є свідченням активної інфекції, а чотириразове наростання титрів IgG в парних сироватках у ВІЛ-позитивних осіб не спостерігається. Рівні специфічних IgG у ВІЛпозитивних не відображають активності інфекційного процесу, а реплікативні форми ЦМВІ виявляються у пацієнтів із низькими і високими титрами, а також у хибно серонегативних (зникнення антитіл на тлі імунодефіциту) [6]. Специфічні антитіла класу IgM певною мірою втратили роль показника активної інфекції, оскільки визначаються у крові після первинного інфікування впродовж 12-18 тижнів і співпадають з реплікативною фазою інфекції менше, ніж у 50% випадків. У ВІЛ-позитивних при свіжому інфікуванні цитомегаловірусом IgM часто взагалі не виробляються, а поява IgG очікується через 3-4 тижні. Отже, відсутність специфічних антитіл класів IgM і IgG ще не виключає наявність гострої ЦМВІ. Подібна ситуація може спостерігатися при реактивації хронічної ЦМВІ в стадії СНІДу, коли синтез антитіл ослаблений настільки, що специфічні IgG та IgM не виявляються методом імуноферментного аналізу (ІФА). На фоні імунної недостатності у новонароджених дітей активний інфекційний процес також рідко супроводжується появою специфічних IgM і підвищенням рівня IgG. Зрідка IgM можуть бути хибнопозитивними через присутність у сироватці крові ревматоїдного фактору або при реплікації інших герпесвірусів за рахунок перехресної реакції. В імуноскомпроментованих жінок із ВІЛінфекцією відсутність антитіл ще не може заперечити наявності активної ЦМВІ. Аналізуючи значимість лабораторних методів діагностики ЦМВІ, дослідники роблять висновок про неінформативність серологічних методів для підтвердження активної інфекції, що особливо притаманно ВІЛпозитивним особам та їхнім новонародженим дітям [1, 2, 6]. Для діагностики реплікативної форми ЦМВІ найчастіше застосовують метод ПЛР, за допомогою якого досліджують кров або інший матеріал від хворого (слину, сечу, ліквор, зішкрябки із цервікального каналу) в залежності від локалізації уражень [3, 8, 10]. Однак, при безсимптомному пере 58449 4 бігу ЦМВІ, який переважає у вагітних (90%), локалізація збудника і зумовленого ним патологічного процесу в організмі невідома. Аналогічна ситуація і при внутрішньоутробній ЦМВІ, яка діагностується на підставі клінічних даних тільки у 10% новонароджених. У таких випадках для верифікації діагнозу ЦМВІ необхідно досліджувати методом ПЛР всі біологічні рідини, в яких може знаходитись вірус, що значно підвищує вартість дослідження і робить його малодоступним для контингенту ВІЛпозитивних (такі дослідження не належать до обов'язкових протокольних обстежень). Слід відзначити, що визначення ДНК ЦМВ методом ПЛР в слині, сечі, цервікальному секреті не завжди свідчить на користь клінічно активної інфекції, оскільки реплікація віруса може бути мінімальна і відповідати «здоровому» вірусоносійству [6, 10]. Через виражений тропізм ЦМВ до епітелію вивідних протоків слинних залоз, звивистих канальців нирок, цервікального каналу його розмноження у цих клітинах супроводжується розвитком повільного цитопатичного ефекту з індукцією цитомегалічного метаморфозу і виникненням ЦМК. Вони великі за розміром (20-40 мкм), мають округлу форму, велике ядро з характерними внутрішньоядерними оксифільними включеннями, оточеними оптично світлою облямівкою, що нагадують «совине око». Якщо ДНК вірусу в сечі та слині можуть виявлятися також при носійстві та хронічних персистентних формах ЦМВІ, то ЦМК - тільки у випадку реплікації й цитопатичної дії вірусу, що робить їх абсолютним доказом активної ЦМВІ при будь-якому варіанті її перебігу, в тому числі безсимптомному, що найчастіше зустрічається у ВІЛ-позитивних жінок репродуктивного віку, вагітних та їхніх новонароджених дітей. Існують методи цитологічної діагностики ЦМВІ шляхом цитоскопії осаду сечі, слини та біосубстрату із піхви і цервікального каналу у світловому мікроскопі, який базується на виявленні патогномонічних для цієї хвороби специфічних цитомегалічних клітин (ЦМК) [10, 12]. Найближчим за суттю до корисної моделі є спосіб діагностики реплікативних безсимптомних форм ЦМВІ у жінок репродуктивного віку, вагітних жінок та новонароджених їхніх дітей, де застосовується визначення цитомегалічних клітин у різноманітних біосередовищах [13]. Однак, недолік методу в тому, що біосубстрат з піхви береться шляхом промивання гігієнічного тампона з піхви у фізіологічному розчині натрію хлориду. Немає достатньої гарантії, що на тканині тампону цитомегалічні клітини можуть зберігатися, а не зазнавати часткового руйнування, що знижує інформативність методу. Крім того, обстеженню підлягали жінки з негативним ВІЛ-статусом, але серопозитивні стосовно наявності протицитомегаловірусних антитіл класу IgG. Спосіб, що заявляється, вперше застосовується з метою цитологічної диференційної діагностики активних безсимптомних форм ЦМВІ у ВІЛінфікованих жінок репродуктивного віку в періоди життя, які пов'язані з вагітністю або підготовкою до неї та в їхніх новонароджених дітей. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено завдання діагностики активних безсимп 5 томних форм ЦМВІ у ВІЛ-інфікованих жінок репродуктивного віку, вагітних жінок та їхніх новонароджених дітей шляхом проведення додаткового цитоскопічного дослідження осаду слини, сечі, змивів із піхви, де виявляють цитомегалічні клітини, які характерні тільки для даної інфекції, і, за наявності навіть однієї такої клітини підтверджують діагноз, а за відсутності - заперечують. Наявність ЦМК, за відсутності антитіл до цитомегаловірусу, свідчить про виражений фоновий імунодефіцит. Наявність цитомегалічних клітин за від'ємного ДНК ЦМВ - свідчить про активну ЦМВІ та недоліки взяття матеріалу на ПЛР. Відсутність цитомегалічних клітин в біосередовищі, за наявності ДНК ЦМВ заперечує активну ЦМВІ, а свідчить про вірусоносійство із мінімальним рівнем реплікації. Суть корисної моделі полягає в тому, що застосовує метод цитоскопічного виявлення ЦМК в біосередовищі у всіх ВІЛ-позитивних жінок репродуктивного віку, які перебувають в періоді підготовки до вагітності або під час вагітності, в їхніх новонароджених дітей, як основне підтверджуюче дослідження для лабораторної діагностики активної безсимптомної форми ЦМВІ. Наявність суттєвих ознак у корисній моделі полягає в тому, що метод застосовує цитоскопічне дослідження на визначення цитомегалічних клітин у в контингенті ВІЛ-інфікованих жінок репродуктивного віку та їхніх новонароджених дітей незалежно від наявності чи відсутності клінічних проявів ЦМВІ, специфічних протицитомегаловірусних антитіл класів IgM, IgG, позитивного чи негативного якісного ПЛР на виявлення ДНК ЦМВ. Спосіб здійснюється наступним чином. Всім жінкам із підтвердженою ВІЛ-інфекцією на етапі прегравідарної підготовки береться біосубстрат з піхви після ранкового туалету шляхом спринцювання 50,0 мл 0,9% фізіологічного розчину натрію хлориду з наступним осадженням клітинного вмісту цетрифугуванням. Отримана змивна рідина переноситься у центрифужні пробірки, центрифугується при 3000 об/хв впродовж 15 хв, надосадову рідину зливають, а осад ресуспензують у 1 мл фізіологічного розчину і відразу наносять на знежирене предметне скло тонким шаром. Для отримання осаду сечі та слини беруть їх перші ранкові проби, об'ємом не менше 10 мл, центрифугують при вище зазначеному режимі, аналогічно ресуспензують і виготовляють мазки. Мазки висушують при температурі 18-20° градусів, фіксують в етиловому спирті або суміші Нікіфорова протягом 1520 хвилин, забарвлюють за методом Романовського-Гімзе гематоксилін-еозином і вивчають під світловим мікроскопом (збільшення 40×10). У новонароджених на дослідження беруть сечу та зішкрябок зі слизової щік. Зішкрябок шпателем чи ватним тампоном одразу наноситься на предметне скло з подальшою фіксацією і фарбуванням. 58449 6 Мікроскопію здійснюють у світловому мікроскопі (збільшення: об'єктив ×40, окуляр ×10). Результат реакції оцінюють за чотирихрестовою схемою: наявність ЦМК в препараті у великій (++++ - більше 20 ЦМК), помірній (+++ - 10-20 ЦМК) і малій (++,+ - до 10 ЦМК) кількості. Застосування способу, що заявляється, базується на проведених порівняльних дослідженнях ефективності різних методів діагностики безсимптомних форм ЦМВІ у жінок і новонароджених методом ІФА, ПЛР та цитологічного дослідження. Із представлених даних у таблицях 1 і 2 видно, що як у жінок, так і новонароджених дітей відсоток позитивних результатів цитологічного дослідження будь-якого біологічного матеріалу не відрізнявся у порівнянні з відсотком позитивних результатів ПЛР, а у вагінальних змивах - перевищував її. Останнє мабуть пов'язане зі складнощами методики взяття матеріалу з цервікального каналу для ПЛР. Таблиця 1 Маркери цитомегаловірусної інфекції у ВІЛпозитивних жінок Кількість жінок з Групи ВІЛпозитивними репозитивних жінок, Кількість зультатами матеріал та метод обстежених абс. дослідження % число Серопозитивні на ЦМВІ (n=30) ПЛР: 30 18 60,0 Слина 30 15 50,0 Сеча 30 9 30,0 Зішкрябок із церві30 18 60,0 кального каналу Цитоскопія мазків 30 23 76,67 біосубстрату: Слина 30 15 50,0 Сеча 30 10 33,33 Вагінальний змив 30 20 66,67 Серонегативні на ЦМВІ (n=12) ПЛР: 12 4 33,33 Слина 12 2 16,67 Сеча 12 1 8,33 Зішкрябок із церві12 4 33,33 кального каналу Цитоскопія мазків 12 4 33,33 біосубстрату: Слина 12 2 8,33 Сеча 12 1 8,33 Вагінальний змив 12 3 25,0 7 58449 8 Таблиця 2 Маркери цитомегаловірусної інфекції у ВІЛ-позитивних новонароджених дітей Матеріал і метод дослідження новонароджених Серологічний (ІФА) ПЛР: Слина Сеча Цитологічний (цитоскопія): Зішкрябок зі слизової оболонки щік Сеча Отже, результати порівняльного дослідження свідчать про високу діагностичну інформативність цитоскопічного визначення цитомегалічних клітин. У жінок найінформативнішими виявилися результати цитологічного дослідження вагінальних змивів, а в новонароджених - зішкрябка зі слизової щік. Впровадження цитологічного дослідження біологічного матеріалу у жінок репродуктивного віку, вагітних і новонароджених на предмет наявності ЦМК дозволяє вчасно діагностувати реплікативні безсимптомні форми ЦМВІ, призначити адекватне лікування з метою профілактики її несприятливого впливу на перебіг вагітності, стан плода і новонародженого. Методика здійснення цитоскопії проста, не вимагає складних пристосувань, коштовного лабораторного обладнання, спеціальної підготовки персоналу. Цей високоспецифічний метод діагностики ЦМВІ з достатньо хорошою чутливістю є абсолютно доступним в умовах загально-клінічних лабораторій лікарень, центрів профілактики і боротьби з ВІЛ-інфекцією та СНІДом, жіночих консультацій, ЦРЛ, амбулаторій. Література: 1. Дикий Б.М., Грижак І.Г., Щербинська А.Д., Воляк М.Н., Нейко Н. Медико-профілактичні аспекти ВІЛ-інфекції та СНІДу в лікарській практиці. Івано-Франківськ, Видавництво ІФДМУ, 2007. - 236 с. 2. Запорожан В.М., М.Л. Аряєв ВІЛ-інфекція і СНІД. 2-ге видання перероб. і доп. - Київ: "Здоров'я", 2004 р. - 636 с. 3. Кистенева Л.Б. Цитомегаловирусная инфекция как проблема перинатальной патологии: этиология, патогенез, диагностика // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2003. - №4. - С. 55-59. 4. Матейко Г.Б. Цитомегаловірусна інфекція у вагітних: особливості перебігу, ризик інфікування плода // Інфекційні хвороби. - 2004. - №4. - С 4143. Комп’ютерна верстка А. Рябко Кількість обстежених 15 15 15 15 15 15 15 Кількість новонароджених з позитивними результатами абс. число % 100 4 26,67 4 26,67 0 4 26,67 4 26,67 1 6,67 5. Матейко Г.Б. Вплив герпетичної та цитомегаловірусної інфекції на перебіг вагітності і пологів // Галицький лікарський вісник. - 2004. - №3. - С. 57-59. 6. Матейко Г.Б. Значимість серологічних і вірусологічних маркерів в діагностиці цитомегаловірусної інфекції у вагітних жінок // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2004. Т.8, №2. - С. 513-514. 7. Никонов А.П., Асцатурова О.Р. Цитомегаловирусная инфекция и беременность // Акушерство и гинекология. - 2003. - №1. - С. 53-57. 8. Нисевич Л.Л., Бахмут Е.В., Королькова Е.Л. К вопросу о диагностике внутриутробной инфекции у новорождѐнных // Акуш. и гинекол. - 1998. №3.- С. 16-20. 9. Орджоникидзе Н.В., Тютюнник В.Л. Цитомегаловирусная инфекция и беременность // Акушерство и гинекология. - 2002. - №3. - С. 56-63. 10. Прилуцький О.С. Діагностика цитомегаловірусної інфекції у вагітних жінок, плода, новонароджених // Лабораторна діагностика. - 2003. - №2. - С. 3-7. 11. Серов В.Н., Манухин И.Б., Кузьмин В.Н. ЦМВИ: патология беременности и плода // Акуш. и гинекол. - 1997. - №6. - С. 16-20. 12. Смілянська М.В. Лабораторна діагностика цитомегаловірусної інфекції // Інфекційні хвороби. - 1998. - №2. - С. 50-51. 13. Спосіб діагностики реплікативнихбезсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції у жінок репродуктивного віку, вагітних та новонароджених / Г.Б. Матейко, Р.С. Остяк, Л.Й. Погоріла / Деклараційний пат. Україна, №21854 UA, МКВ А61В5/00 (2006). 14. Тютюнник В.Л., Орджоникидзе Н.В., Зыряева Н.А. Перинатальные аспекты цитомегаловирусной инфекции // Акушерство и гинекология. 2002. - №1. - С. 9-11. 15. Усачова О.В. Роль цитомегаловірусів у патології вагітності, плоду та дітей раннього віку / Інфекційні хвороби. - 2008. - №2. - С. 18-23. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601