Спосіб мікроклонального розмноження рослин роду populus

Спосіб мікроклонального розмноження рослин роду Populus, що включає ініціацію стерильної культури, отриманої стерилізацією маточного матеріалу, вичленення точок росту, висадку їх на поживне середовище, мультиплікацію експлантів шляхом вирощування, розділення на частини, регенерації з них, який відрізняється тим, що для ініціації стерильної культури і підвищення швидкості й якості мультиплікації експлантів різних генотипів використовують середовище MS, в яке додатково вводять бензиламінопурин у концентрації 0,15-0,3 мг/л. (19) (21) u201012681 (22) 26.10.2010 (24) 11.04.2011 (46) 11.04.2011, Бюл.№ 7, 2011 р. (72) ГРОДЗИНСЬКИЙ ДМИТРО МИХАЙЛОВИЧ, РАШИДОВ НАМІК МАМЕД ОГЛИ, КУЦОКОНЬ НАТАЛІЯ КОСТЯНТИНІВНА, ГУЩА МИКОЛА ІВАНОВИЧ, ШИЛІНА ЮЛІЯ ВОЛОДИМИРІВНА, ВОЛОСЯНЧУК РОМАН ТАРАСОВИЧ, ТКАЧ ВІКТОР ПЕТРОВИЧ, ЗОЛОТИХ ІРИНА ВІКТОРІВНА, ВИСОЦЬКА НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, РАКШАСЛЮСАРЕВА ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА, КРУЛЬ ВІКТОРІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА 3 БАП в концентрації 0,15-0,3 мг/л. Це дає можливість швидко отримати велику кількість високоякісного й відносно дешевого садивного матеріалу роду Populus. Суть способу, що заявляється, полягає у додатковому введенні у середовище MS для ініціації стерильної культури і мультиплікації експлантів відповідних генотипів роду Populus бензиламінопурину у концентрації 0,15-0,3 мг/л. Новим у способі, що заявляється є те, що для ініціації стерильної культури і підвищення швидкості й якості мультиплікації експлантів відповідних генотипів роду Populus використовується середовище MS з додаванням БАЛ у концентрації 0,150,3 мг/л. Представники роду Populus є одними з найбільш швидкорослих серед деревних порід, мають деревину задовільної якості, внаслідок чого вирощуються для ряду господарчих потреб. Тополі є джерелом енергії для виробництва етанолу і при спалюванні (дрова, деревне вугілля, пелети, брикети); сировиною для виробництва паперу, віскози; для виготовлення сірників, фанери, пиломатеріалів, тари); їх використовують у захисних лісосмугах та для декоративних цілей. Більшість видів можуть розмножуватися живцями, але оптимальнішим з точки зору швидкості та ефективності розмноження є метод мікроклонування, який раціонально застосовувати для найбільш цінних генотипів та при здійсненні генно-інженерних робіт. Мультиплікація рослинного матеріалу можлива, по-перше, за рахунок розрізання довгих пагонів на окремі міжвузля та їх подальшого культивування, та, по-друге, за рахунок утворення адвентивних бруньок. Найбільш ефективною для тополь є мультиплікація за рахунок адвентивних бруньок, оскільки з одного експланту можна отримати декілька добре сформованих пагонів і завдяки цьому значно підвищити коефіцієнт мультиплікації. Для культивування різних видів тополь дослідники використовували від 1 до 9 типів базальних середовищ [4. Edvin F. George Ph.D. Plant propagation by tissue culture. Part 2 In practice. 2-nd edition, 1993/1996. Exgenetics Limited. - 1333p.]. Проте, часто для кожного генотипу необхідно підбирати окремо найбільш оптимальне живильне середовище з фітогормонами, що при незначній кількості маточного рослинного матеріалу та інколи стислих термінах для введення в культуру може мати критичне значення. Таким чином, існуючі способи мультиплікації садивного матеріалу не завжди ефективні, бо не розраховані на представників роду Populus, або не уніфіковані й стосуються тільки окремих представників цього роду, або призводять до сомаклональної мінливості і є не економічно вигідними. Спосіб виконується наступним чином. Шляхом стерилізації маточного матеріалу (спочатку в 70% етанолі, потім в мертиоляті натрію) і вичлененням точок росту ініціюють стерильну культуру тополь, яку висаджують на поживне середовище. Для ініціації стерильної культури та швидкої мультиплікації експлантів відповідних генотипів використовується середовище MS, що включає MS солі (1/2 стандартної концентрації), MS вітаміни, 20 г цукро 58505 4 зи, 0,75% агар, рН 5,8 з додаванням БАЛ у концентрації 0,3 мг/л. Після посадки на поживне середовище ініціації експланти витримують 3-4 доби у темряві за температури 23°С, після чого переносять у світлову кімнату з такою ж температурою та освітленням близько 1500 люкс/м та світловим режимом 16 годин – день / 8 годин - ніч. Пересадку експлантів з виснаженого середовища на нове проводять кожні 4 тижні. При досяганні пагонами довжини 1,5-3 см та утворенні сформованих листочків або численних адвентивних бруньок, їх використовують для мультиплікації. Мультиплікацію експлантів проводять шляхом вирощування, розділення на частини й регенерації з них. Кожні 4 тижні пагони розрізають на сегменти з 1-2 міжвузлями довжиною 1-1,5 см та знову висаджують на відповідне середовище. Після цього рослини акліматизують до умов відкритого ґрунту з використанням торфових таблеток Jiffi-7 (Jiffy International). Приклад 1. Отримували експланти рослин роду Рорulus семи генотипів тополь селекції Українського науково-дослідного інституту лісового господарства і агролісомеліорації (м. Харків): «Новоберлінська», «Дружба», «Гулівер», «Перспективна», «Львівська», «Західна», «Лубенська» за найбільш близьким за технічною сутністю до способу, що заявляється, методом [3. Пінчук А.П. Особливості мікроклонального розмноження та адаптації садивного матеріалу гібриду тополі сірої х тополі білої (Populus canescense Sm. х Populus alba L.). - Автореф. дис. канд. сільськогосп. Наук 06.03.01. - Київ, 2004 - 18с.]. Для цього шляхом стерилізації маточного матеріалу (спочатку в 70% етанолі, потім в мертиоляті натрію) і вичлененням точок росту ініціюють стерильну культуру тополь, яку висаджують на поживне середовище. Для ініціації стерильної культури та швидкої мультиплікації експлантів відповідних генотипів використовується середовище GD, що включає GD солі (1/2 стандартної концентрації), MS вітаміни, 20 г цукрози, 0,75% агар, рН 5,8. до середовища додавали фітогормони: 0,3мг/л бензиламінопурину (БАП). Після посадки на поживне середовище ініціації експланти витримують 3-4 доби у темряві за температури 23°С, після чого переносять у світлову кімнату з такою ж температурою та освітленням близько 1500 люкс/м2 та світловим режимом 16 годин – день / 8 годин - ніч. Пересадку експлантів з виснаженого середовища на нове проводять кожні 4 тижні. При досяганні пагонами довжини 1,5-3 см та утворенні сформованих листочків або численних адвентивних бруньок, їх використовують для мультиплікації. Мультиплікацію експлантів проводять шляхом вирощування, розділення на частини й регенерації з них. Кожні 4 тижні пагони розрізають на сегменти з 1-2 міжвузлями довжиною 1-1,5 см та знову висаджують на відповідне середовище. Після цього рослини акліматизують до умов відкритого ґрунту з використанням торфових таблеток Jiffi-7 (Jiffy International). У результаті реалізації відомого способу отримали пагоноутворення зразків рослин роду Populus лише на 34,62±4,17% експлантів, серед 5 них частка довгих повноцінних пагонів становила 0,77±0,77%. Середній коефіцієнт мультиплікації для 7 тестових генотипів становив 1,6 за один пасаж (від 1,25 до 2,00 для різних генотипів) і був найвищим для клонів «Західна» та «Новоберлінська». Приклад 2. Отримували експланти рослин роду Populus семи генотипів тополь селекції Українського науково-дослідного інституту лісового господарства і агролісомеліорації (м. Харків) («Новоберлінська», «Дружба», «Гулівер», «Перспективна», «Львівська», «Західна», «Лубенська») за способом, що заявляється. Для цього шляхом стерилізації маточного матеріалу (спочатку в 70% етанолі, потім в мертиоляті натрію) і вичлененням точок росту ініціюють стерильну культуру тополь, яку висаджують на поживне середовище. Для ініціації стерильної культури та швидкої мультиплікації експлантів відповідних генотипів використовується середовище MS, що включає MS солі (1/2 стандартної концентрації), MS вітаміни, 20 г цукрози, 0,75% агар, рН 5,8 з додаванням БАЛ у концентрації 0,1 мг/л. Після посадки на поживне середовище ініціації експланти витримують 3-4 доби у темряві за температури 23°С, після чого переносять у світлову кімнату з такою ж температурою та освітленням близько 1500 люкс/м2 та світловим режимом 16 годин – день / 8 годин - ніч. Пересадку експлантів з виснаженого середовища на нове проводять кожні 4 тижні. При досяганні пагонами довжини 1,5-3 см та утворенні сформованих листочків або численних адвентивних бруньок, їх використовують для мультиплікації. Мультиплікацію експлантів проводять шляхом вирощування, розділення на частини й регенерації з них. Кожні 4 тижні пагони розрізають на сегменти з 1-2 міжвузлями довжиною 1-1,5 см та знову висаджують на відповідне середовище. У результаті здійснення способу отримували пагоноутворення на 61,67±4,44% експлантів, у т.ч. 6,67±2,28% повноцінних пагонів. Середній коефіцієнт мультиплікації для 7 тестових генотипів становив 1,3 за один пасаж (від 0,75 до 1,73 залежно від генотипу) і був найвищим для сортів «Західна» та «Гулівер». Приклад 3. Отримували експланти рослин роду Populus семи генотипів тополь селекції Українського науково-дослідного інституту лісового господарства і агролісомеліорації (м. Харків) («Новоберлінська», «Дружба», «Гулівер», «Перспективна», «Львівська», «Західна», «Лубенська») за способом, що заявляється. Для цього шляхом стерилізації маточного матеріалу (спочатку в 70 % етанолі, потім в мертиоляті натрію) і вичлененням точок росту ініціюють стерильну культуру тополь, яку висаджують на поживне середовище. Для ініціації стерильної культури та швидкої мультиплікації експлантів відповідних генотипів використо 58505 6 вується середовище MS, що включає MS солі (1/2 стандартної концентрації), MS вітаміни, 20 г цукрози, 0,75% агар, рН 5,8 з додаванням БАЛ у концентрації 0,3 мг/л. Після посадки на поживне середовище ініціації експланти витримують 3-4 доби у темряві за температури 23°С, після чого переносять у світлову кімнату з такою ж температурою та освітленням близько 1500 люкс/м та світловим режимом 16 годин – день / 8 годин - ніч. Пересадку експлантів з виснаженого середовища на нове проводять кожні 4 тижні. При досяганні пагонами довжини 1,5-3 см та утворенні сформованих листочків або численних адвентивних бруньок, їх використовують для мультиплікації. Мультиплікацію експлантів проводять шляхом вирощування, розділення на частини й регенерації з них. Кожні 4 тижні пагони розрізають на сегменти з 1-2 міжвузлями довжиною 1-1,5 см та знову висаджують на відповідне середовище. Після цього рослини акліматизують до умов відкритого ґрунту з використанням торфових таблеток Jiffi-7 (Jiffy International). У результаті здійснення способу отримували пагоноутворення на 72,31±2,55% експлантів, у т.ч. 14,98±2,04% повноцінних пагонів. Середній коефіцієнт мультиплікації для 7 тестових генотипів становив 3,3 за один пасаж (від 1,44 до 9,25 для різних генотипів) і був найвищим для сортів «Західна» та «Дружба». Таким чином отримані результати показали, що середовище MS з додаванням БАП у концентрації 0,3 мг/л є більш ефективним при ініціації та мультиплікації тополь in vitro. Спосіб, що заявляється є найбільш ефективним та вигідним у порівняні з відомими, оскільки дає можливість швидко отримати велику кількість високоякісного садивного матеріалу тополь різних генотипів. Крім того виконання способу є більш економічним, так як замість декількох фітогормонів використовується один і в меншій кількості. Література 1. Thompson D.G., Gordon J.С. Propagation of poplar by shoot apex culture and nutrient film technique. In Tapp Forest Biol.& Wood Chem. Conference, 1977. - pp. 77-82. 2. Chun Y.W., Hall R.B., Stephens L.C. Influence of medium consistency and shoot density on in vitro shoot proliferation of Populus alba x P. grandidentata. // Plant Cell Tissue. Organ Culture, 1986. - №5. - pp. 179-185. 3. Пінчук А.П. Особливості мікроклонального розмноження та адаптації садивного матеріалу гібриду тополі сірої х тополі білої (Populus canescense Sm. X Populus alba L.). - Автореф. дис... канд. сідьськогосп. наук: 06.03.01. - Київ, 2004 - 18с. 4. Edvin F. George Ph.D. Plant propagation by tissue culture. Part 2 In practice. 2-nd edition, 1993/1996. Exgenetics Limited. - 1333p. 7 Комп’ютерна верстка М. Ломалова 58505 8 Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601