Спосіб мікроклонального розмноження унгернії віктора ungernia victoris vved. ex artjuschenko

Спосіб мікроклонального розмноження унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko, який включає експлантацію базальної частини лусок цибулини на штучне живильне середовище для індукції прямої регенерації цибулин наступного складу, мг/л: NH4NO3 400-600 KNO3 1000-1200 (NH4)2SO4 200-400 MgSO4 .7H2O 400-600 Са(NО3)2.4Н2O 800-1000 NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPO4 90-110 KCl 60-80 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4.2H2 O 0,2-0,3 СuSO4.5Н2О 0,02-0,03 СоСl2.6Н2О 0,02-0,03 MnSO4 .5H2O 23-25 2 (19) 1 3 85571 4 Nа2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,8-1,2 піридоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 індолілоцтова кислота 2,0 кінетин 0,02 гідролізат казеїну 40-60 мезоінозит 10-30 сахароза 50000-60000 агар 6000-8000 вода до 1 літра, при цьому одержаний склад доводять до рН 5,86,2 та автоклавують, отримані мікроцибулини вирощують на живильному середовищі наступного складу, мг/л: NH4NO3 400-600 KNO3 1000-1200 (NH4)2SO4 200-400 MgSO4 .7H2O 400-600 . Са(NО3)2 4Н2O 800-1000 NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPO4 90-110 KCl 60-80 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4.2H2 O 0,2-0,3 СuSO4.5Н2О 0,02-0,03 СоСl2.6Н2О 0,02-0,03 MnSO4 .5H2O 23-25 Н3ВО3 5-8 ZnSO4.4H2O 7-9 FeSO4.7H2O 27-28 Nа2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,8-1,2 піридоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 1-нафтилоцтова кислота 0,2-0,5 кінетин 0,02-0,1 гідролізат казеїну 40-60 мезоінозит 15-25 сахароза 50000-60000 агар 6000-8000 вода до 1 літра, при цьому одержаний склад доводять до рН 5,86,2 та автоклавують. Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використаний для прискореного розмноження рослин із їх одночасним оздоровленням від фі топатогенних мікроорганізмів, а також в селекції і насінництві (зокрема, в роботі зі створення штучного насіння), в дослідженнях з фізіології, ембріології та морфогенезу рослин. Унгернія Віктора Ungemia victoris - ендемічна цибулинна рослина, що зростає у горах Таджикистану та Узбекистану. Цибулини і листки унгернії містять важливі для медицини галантамін, лікорин та інші ізохінолінові алкалоїди. Тому сировиною отримання цих алкалоїдів для фармацевтичної промисловості можуть слугува ти як цибулини, так і листки унгернії Віктора. У зв'язку з обмеженими запасами природної сировини збирають листя рослин, яке на місці швидко висушують. Наразі і ця сировинна база є обмеженою, а інтродукція унгернії успіхом не увінчалась. Альтернативою природного розмноження є біотехнологічні методи, зокрема спосіб мікроклонального розмноження в культурі in vitro. Відомі способи мікроклонального розмноження, розроблені для багатьох видів рослин [наприклад 1, 2]. Проте, для унгернії Віктора такі способи невідомі. Завданням винаходу є розробка способу мікроклонального розмноження унгернії Віктора з одночасним прискоренням розвитку регенерантів в культурі in vitro. Зазначене завдання вирішується пропонованим способом індукції прямої регенерації - способом мікроклонального розмноження унгернії Віктора Ungemia victoris Vved. ex Artjuschenko з одночасним прискоренням розвитку регенерантів в культурі in vitro, який включає експлантацію фрагментів лусок цибулини на штучне живильне середовище наступного складу, мг/л: NH4NO3 400-600 KNO3 1000-1200 (NH4)2SO4 200-400 MgSO4×7H2 O 400-600 Ca(NO3)×4H2O 800-1000 NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPO4 90-110 KCl 60-80 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4×2H2O 0,2-0,3 CuSO4×5H2O 0,02-0,03 CoCI2×6H2O 0,02-0,03 MnSO4×5H2 O 23-25 H3BO3 5-8 ZnSO4×4H2O 7-9 FeSO4×7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,8-1,2 пірідоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 гліцин 1,5-2,5 1-нафтилоцтова кислота 0,5-2,2 або індолилоцтова кислота кінетин 0,02-1,2 гідролізат казеїну 50-550 мезоінозит 20-100 сахароза 50000-60000 агар 6000-8000 вода до 1 літра, при цьому одержаний склад доводять до рН 5.8 - 6.2 та а втоклавують,розмноження отриманих цибулинок на живильному середовищі наступного складу, мг/л: NH4NO3 400-600 KNO3 1000-1200 (NH4)2SO4 200-400 MgSO4.7H2O 400-600 Ca(NO3)2×4H2O 800-1000 NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPO4 90-110 5 85571 KCl 60-80 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4×2H2OO 0,2-0,3 CuSO4×5H2O 0,02-0,03 CoCI2×6H2O 0,02-0,03 MnSO4×5H2 O 23-25 H3BO3 5-8 ZnSO4×4H2O 7-9 FeSO4×7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,8-1,2 пірідоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 індолилоцтова кислота 1,8-2,2 кінетин 0,02 гідролізат казеїну 40-60 мезоінозит 10-30 сахароза 50000-60000 агар 6000-8000 вода до 1 літра, при цьому одержаний склад доводять до рН 5.8-6.2 та автоклавують, та вирощування (культивування) отриманих мікроцибулин на живильному середовищі наступного складу, мг/л: NH4NO3 400-600 KNO3 1000-1200 (NH4)2SO4 200-400 MgSO 4.7H2 O 400-600 Ca(NO3 )24H 2 O 800-1000 NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPO4 90-110 KCl 60-80 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4 .2H2O 0,2-0,3 CuSO 4 ×5H 2O 0,02-0,03 CoCI2 ×6H 2O 0,02-0,03 MnSO 4×5H2O 23-25 H3BO3 5-8 ZnSO4×4H2O 7-9 FeSO4×7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,8-1,2 пірідоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 1-нафтилоцтова кислота 0,2-0,5 кінетин 0,02-0,1 гідролізат казеїну 40-60 мезоінозит 15-25 сахароза 50000-60000 агар 6000-8000 вода до 1 літра, при цьому одержаний склад доводять до рН 5.8-6.2 та автоклавують. Індукують пряму регенерацію наступним чином. Цибулину унгернії, що знаходиться у стадії спокою, очищали від зовнішніх сухи х лусок, знімали додатково 1-2 шари зовнішніх живих лусок. Після стерилізації загальноприйнятими методами [1], очищену цибулин у в стерильних умовах розділяли на окремі луски. Для роботи використовували базальну частину лусок, для чого від кожної луски відрізали верхню третину, яку видаляли. Базальні 6 частини лусок нарізали скальпелем на шматки (фрагменти, експланти) розміром 0,5-1 х 0,5-1 см і висаджували на живильне середовище з мінеральною основою за [3], в яке додатково вносили стимулятори росту, зокрема, ауксини та цитокініни. Готували живильне середовище 5С01 наступного складу, мг/л: NH4NO3 400-600 KNO3 1000-1200 (NH4)2SO4 200-400 MgSO 4×7H2O 400-600 Ca(NO3 )2 ×4H2 O 800-1000 NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPO4 90-110 KCl 60-80 KJ 0,8-0,9 Na2MoO4×2H2O 0,2-0,3 CuSO 4 ×5H 2O 0,02-0,03 CoCI2 ×6H 2O 0,02-0,03 MnSO 4×5H2O 23-25 H3BO3 5-8 ZnSO4×4H2O 7-9 FeSO4×7H2O 27-28 Na2 ЕДТА 37-38 тіамін 0,8-1,2 пірідоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 гліцин 1,5-2,5 1-нафтилоцтова кислота 1,8-2,2 кінетин 0,8-1,2 гідролізат казеїну 450-550 мезоінозит 70-100 сахароза 50000-60000 агар 6000-8000 вода до 1 літра, при цьому одержаний склад доводили до рН 5.8-6.2 та автоклавували. Середовище розливали у пробірки або колби і стерилізували гарячою парою при 1атм. 15-20хв. Для роботи використовували охололе середовище. Приклад 1. Пробірки або колби з висадженими в асептичних умовах первинними експлантами ставили у термостатоване темне приміщення (t°=24-26°C, відносна вологість повітря - 70-80%). Через 30-60 діб на експлантах утворювалися мікроцибулинки. Кількість експлантів, здатних формувати регенеранти, складала близько 30%, на кожному з яких утворювалося в середньому по 2 мікроцибулинки (табл.). Приклад 2. Готували живильне середовище як вказано вище, у якому кількість 1-нафтилоцтової кислоти (НОК) зменшили до 0,5мг/л, кінетину - до 0,02мг/л, мезоінозиту - до 20мг/л, гідролізату казеїну - до 50мг/л (середовище 5СЗН). За тих самих умов вирощування на ізольованих фрагментах лусок через 30-60 діб культивування утворювалися мікроцибулини. Кількість експлантів, здатних формувати регенеранти, складала близько 35%, на кожному з яких утворювалися в середньому по 3 мікроцибулини (табл.). Приклад 3. Готували живильне середовище за прикладом 2, зі складу якого вилучали НОК і додатково вносили 2мг/л індолилоцтової кислоти - ІОК 7 85571 (середовище 5СЗІ). За тих самих умов через 30-60 діб культивування на близько 59% експлантів утворювалися мікроцибулини, на кожному з таких експлантів утворювалося в середньому по 4 мікроцибулини (табл.). Подальше розмноження (мультиплікацію) цибулинок, отриманих за прикладами 1-3, проводили на середовищі, приготовленому за прикладом 3 (на середовищі 5СЗІ). Для цього кожну цибулинкурегенерант відділяли від експланту, на якому вона утворилась, і переносили на середовище 5СЗІ. Кожна окрема цибулинка через 30-40 діб утворювала 3-6 і більше нових мікроцибулин. За необхідності подальшого розмноження утворений пучок цибулинок поділяли на окремі цибулинки і знову переносили на те саме середовище. Здатність регенерованих цибулин до мікророзмноження (мультиплікації) на середовищі 5СЗІ зберігається щонайменше протягом 5 років. Для прискореного розвитку окремих цибулинок їх переносили на середовище 5СЗН (склад середовища наведено в прикладі 2), у якому кількість НОК зменшували до 0,2мг/л. Пробірки з висадженими цибулинками ставили в термостатовані умови (22-26°С) з 14-16-годинним світловим днем і з освітленням 1000-2500 люкс. Через 20-40 діб цибулинки формували корені і листочки і росли, а через 50-60 діб переходили до стану спокою, при цьому листочок засихав. За перенесенням сплячої цибулини на свіже середовище, вона знову формувала 1-2 листочки (залежно від віку цибулини) і 8 весь цикл повторювався. У результаті такого процесу мікроцибулини за 1,5-2 роки вирощування in vitro досягали стадії розвитку, яка відповідає віку 5-7-річних цибулинок, отриманих із насіння у разі їх росту в природних умовах. Використання живильних середовищ іншого складу, зокрема, з мінеральною основою МурасігеСкуга, Лінсмаєр-Скуга, Гамборга В5, Еріксона, Уайта (склад середовищ див [2]), які містили різні кількості та співвідношення органічних добавок, було малоефективним - індукцію регенерації мікроцибулинок спостерігали рідко, менше ніж на 12% експлантів. Таким чином, розроблений спосіб дозволяє прискорено розмножувати ендемічну лікарську рослину унгернію Віктора, при цьому від однієї цибулини можливо за 1,5-2 роки отримувати понад 1млн. цибулин, стадія розвитку яких відповідає природним цибулинам 5-7-річного віку. Література: 1. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. К., Наук, думка, 1992.-230 с. 2. Кушнір Г.П., Сарнацька В.В. Стан і перспективи клонального мікророзмноження рослин в Україні // В кн.: Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. Т. 1. К., Логос, 2001, с. 484-500. 3. Воллосович А.Г., П учинина Т.Н., Николаева Л.А. Оптимизация состава макросолей для культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. // Растительные ресурсы, 1979,15, №4, с. 516-528. Таблиця Результати мікророзмноження унгернії Віктора на основі культивування in vitro фрагментів лусок цибулини шляхом прямої регенерації за прикладами 1-3 Номер цибулини Цибулина №1 №2 №3 В середньому Цибулина №1 №2 №3 В середньому Цибулина №1 №2 №3 В середньому Вивчено експлантів, Експланти, що регенеру- Середня кількість мікроцибулин на ексшт. вали мікроцибулини, % плант, що їх регенерує Приклад 1 (живильне середовище 5С01) 190 29,5±3,3 2,1 108 27,8±4,3 1,8 127 33,1 ±4,2 1,9 425 30,1±2,2 2,0 Приклад 2 (живильне середовище 5СЗН) 114 35,1 ±4,4 3,2 93 34,4±4,9 3,0 139 36,0±4,1 3,1 346 35,3±2,6 3,1 Приклад 3 (живильне середовище 5С3І) 175 61,1±3,7 4,3 113 57,5±4,7 3,9 162 58,0±3,9 3,9 450 59,1±2,3 4,1 Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601