Вакцинний штам fusobacterium necropнorum-к

Штам Fusobactenum necrophorum-K, який депонований в колекції мікроорганізмів Державного Винахід відноситься до ветеринарної мікробіологи, зокрема, до нового штаму анаеробного мікроорганізму, що використовується для виготовлення вакцини проти некробактерюзу сільськогосподарських тварин Аналогом винаходу є лабораторний штам Fusobactenum necrophorum BN-2, що був використаний для виготовлення анатоксин-вакцини проти некробактерюзу [2] До недоліків даного штаму мікроорганізму можна віднести те, що він використовується для виділення токсину при виробництві анатоксин-вакцини, а профілактичний ефект такої вакцини невисокий - 33,3% [3] Прототипом винаходу є колекційний штам Fusobactenum necrophorum 2030A, що зберігається в колекції кафедри епізоотології та інфекційних хвороб Московської Державної академії ветеринарної медицини та біотехнологм (м Москва) [4] Подібними ознаками прототипу із заявленим штамом є те, що він високо токсигенний та патогенний для білих мишей і при культивуванні на кров'яному агарі викликає гемоліз еритроцитів, а також володіє подібними морфологічними та культурально-бюхімічними властивостями Подібним також є те, що цей штам використовується для виробництва шактивованої асоційованої вакцини проти некробактерюзу великої рогатої худоби - "Нековак" [4] ВІДМІННИМИ ознаками прототипу від заявленого штаму є такі - штам задепонований в колекції мікроорганізмів Російської Федерації і на Україні даного штаму мікроорганізму немає, науково-контрольного інституту біотехнологм і штамів мікроорганізмів і має реєстраційний номер 142 від 05 08 2002 року, використовується для виробництва шактивованої асоційованої вакцини проти некробактерюзу сільськогосподарських тварин, володіє стабільними морфологічними та культурально-бюхімічними властивостями і викликає 100%-ну загибель білих мишей при підшкірному введенні в дозі 0,5 см 3 та концентрації мікробних клітин 6,6x10 - для виробництва вакцини використовується бульйонна 2-х добова культура Fusobactenum necrophorum 2030А - вакцина "Нековак", компонентом якої є антиген із штаму, що взятий за прототип, не завжди має бажаний ефект при вакцинації великої рогатої худоби і не забезпечує високої імуногенності у щепленого поголів'я [2] Метою даного винаходу є вакцинний штам Fusobactenum necrophorum - К ("Київський"), який володіє стабільними морфологічними, культурально-бюхімічними та добре вираженими патогенними властивостями і виділений з матеріалу відібраного від великої рогатої худоби з ознаками некробактерюзу в одному із господарств Київської області Штам Fusobactenum necrophorum - К, отриманий шляхом культивування ізоляту з уражених ділянок дистальних ВІДДІЛІВ КІНЦІВОК великої рога тої худоби, співробітниками лабораторії анаеробних інфекцій IBM УААН Штам Fusobacfenum necrophorum К депонований в колекції мікроорганізмів Державного науково-контрольного інституту біотехнологм і штамів мікроорганізмів і має реєстраційний номер 142 від 5 08 2002р Морфологічні властивості У мазках із бульйонних та агарових культур, штам Fusobactenum necrophorum - К має вигляд коротких ниток, рідше поодиноко розміщених паличок Бактерія за Грамом фарбується негативно, спор та капсул не утворює При фарбуванні за Муромцевим, має вигляд тонких нитчастих форм з чітко вираженою ю 00 00 ю 58875 мілкою зернистістю Культуральні властивості При культивуванні на середовищі Кітта-Тароцці (рН = 7,4±0,2, оптимальна температура 37±1,0 °С), ріст штаму Fusobacterium necrophorum - К проявляється вже через 24-36 годин, при цьому ріст супроводжується утворенням рівномірного помутніння та газу, що має неприємний гнилісний запах При подальшому культивуванні утворюється пухкий осад на шматочках печінки На кров'яному та глюкозо-сироватковому агарі штам Fusobacterium necrophorum - К утворює дрібні росинчасті колонії до 1мм в діаметрі, котрі через 4-5 діб стають добре видимими сірувато-білого кольору з рівними краями На кров'яному агарі утворює зону гемолізу Ферментативні властивості Штам Fusobacterium necrophorum - К ферментує з утворенням кислоти і газу глюкозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, не ферментує фруктозу, маніт, дульцит Утворює індол та сірководень Таблиця 1 БІОХІМІЧНІ властивості штаму Fusobacterium necrophorum - К Винахід ілюструється наступними прикладами Приклад 1 Штам Fusobacterium necrophorum К (культура 1), отриманий шляхом культивування ізоляту з уражених ділянок дистальних ВІДДІЛІВ КІНЦІВОК великої рогатої худоби, відселекційований, як такий, що володіє характерними для роду Fusobacterium, родини Ractenodaceae морфологічними та культурально-бюхімічними властивостями Був патогенним для білих мишей, оскільки при підшкірному та внутрішньочеревному введенні двохдобової бульйонної культури в дозі 0,5 с м 3 по 10 тварин на кожне введення, гинуло 90-100% тварин при 100% збереженні у контролі Приклад 2 Штам Fusobacterium necrophorum К (культура 2), отриманий шляхом культивування ізоляту з уражених ділянок печінки великої рогатої худоби, що володіє характерними для роду Fusobacterium, родини Bacteriodaceae морфологічними та культурально-бюхімічними властивостями, але був слабо патогенним для білих мишей, оскільки при підшкірному та внутрішньочеревному введенні бульйонної культури в дозі 0,5 с м 3 по 10 тварин на кожне введення, гинуло 10-20% тварин при 100% збереженні у контролі + + + + + + Глюкоза Мальтоза Фруктоза Галактоза Сахароза Маніт Дульцит Утворення індолу Утворення сірководню Патогенні властивості Штам Fusobacterium necrophorum - К має виражені патогенні властивості для великої рогатої худоби, кролів та білих мишей У кролів на 4-5 добу при підшкірному введенні в дозі 1,0 с м 3 викликає некроз на МІСЦІ ІН'ЄКЦІЇ та загибель тварин на 7-9 добу Викликає 100%-ну загибель білих мишей в дозі 0,5 с м 3 та концентрацією мікробних клітин 6,6x10 1 2 Стабільність вірулентності встановлена шляхом 5-ти кратних пасжів через організм білих мишей та лабораторних спостережень на протязі кількох років Таблиця 2 Порівняльна характеристика властивостей прототипу та штамів Fusobacterium necrophorum Морфологія Штами F F 1) F 2) F 3) necrophorum 2030 necrophorum - К (культура necrophorum - К (культура necrophorum - К (культура Н П Термін культивування штаму Гемоліз еритроцитів Наявність токсину Патогенність для білих мишей + 2 доби + + 9/10 + ± 7 діб + + 10/10 + 7 діб + 2/10 + 7 діб + 4/10 Примітка Н - нитчаста форма, П - поліморфна форма Приклад 3 Штам Fusobaclenum necrophorum К (культура 3), отриманий шляхом культивування ізоляту з уражених легень великої рогатої худоби, що володіє характерними для роду Fusobacterium, родини Bacteriodaceae морфологічними та культурально-бюхімічними властивостями, але був слабо патогенним для білих мишей, оскільки при підшкірному та внутрішньочеревному введенні бульйонної культури в дозі 0,5 с м 3 по 10 тварин на кожне введення, гинуло 30-40% тварин при 100% збереженні у контролі Порівняльна характеристика властивостей прототипу та випробуваних і вищезазначених прикладів наведені в таблиці 2 Імуногенні властивості Із штаму Fusobacterium necrophorum - К була виготовлена моновакцина для встановлення імуногенності штаму у дослідах на білих мишах та кролях Лабораторних тварин щепили підшкіряно ДВІЧІ з інтервалом 14 діб у дозах білих мишей по 0,5 с м 3 , кролів по 1,0 см з концентрацією мікробних клітин 4 м л р д м к / с м 3 На 10-ту добу після другого щеплення провели 58875 гостре зараження дослідних та контрольних (не щеплені) тварин бульйонною культурою штаму Fu so bacterium necrophorum - К в дозі 0,5 см 3 та концентрацією мікробних клітин 6,6х1012 Тварини із дослідної групи залишилися живими у порівнянні 6 із 100%-вою загибеллю в контролі Титри антитіл у сироватці крові кролів, щеплених моновакциною із штаму Fusobactenum necrophorum - К наведені у таблиці З Таблиця З Динаміка титрів антитіл в РИГА у кролів, щеплених моновакциною із штаму Fusobaclenum necrophorum - К Термін дослідження Група тварин Дослід Титри Антитіл не виявлено Контроль ВИХІДНІ дані Після 1-ГО щеплення на 7-у добу на 14-у добу Після 2-ГО щеплення на 7-у добу на 14-у добу на 30-у добу Антитіл не виявлено Отже, встановлено, що моновакцина із штаму Fusobactenum necrophorum - К є імуногенною Крім того, вакцина не викликає поствакцинальних ускладнень і викликає імунологічну ВІДПОВІДЬ та формування специфічних антитіл Антигенні властивості Визначення антигенної спорідненості штаму Fusobactenum necrophorum К з іншими епізоотичними штамами Fusobactenum necrophorum проводили по їх типізації з протинек ід 1 4-1 16 1 32-1 64 0,6-1,2 1,5-1,8 1 256-1 512 1 512-1 1024 1 256-1 512 2,4-2,7 2,7-3,0 2,4-2,7 робактерюзними сироватками в РИГА Досліджено 5 різних епізоотичних штамів F necrophorum, які були найбільш репрезентативними представниками роду Fusobactenum серед виділених по морфологічним, культуральним, біохімічним та вірулентним властивостям Сироватки були виготовлені нами шляхом пперімунізаци кролів, вищезазначиними штамами Результати наведені у таблиці 4 Таблиця 4 Показники антигенної спорідненості штамів F necrophorum Максимальні титри в PA з сироватками Штам F F F F F necrophorum ДН-97 necrophorum - К necrophorum XC necrophorum ЧН-2000 necrophorum ДОН F necrophorum F necrophorum F necrophorum F necrophorum F necrophorum ДН-97 -К XC ЧН-2000 ДОН 1 2048 1 124 1 512 1 124 1 512 1 124 1 2048 1 32 1 512 1 512 Як видно з таблиці 4, титри антитіл в протинекробактерюзних сироватках до гомологічних штамів F necrophorum в РИГА становили 1 2048 Високо вираженою серологічною спорідненістю між собою володіли штами F necrophorum - К, F necrophorum ЧН-2000, F necrophorum ДОН Титри антитіл в перехресній РИГА між цими антигенами становили 1 512 Результати досліджень свідчать про те, що запропонований штам Fusobactenum necrophorum - К володіє високою патогенністю, має антигенну спорідненість з іншими епізоотичними штамами Fusohactermm necrophomm, а також придатний для виробництва вакцини проти некробактерюзу, 1 512 1 32 1 2048 1 32 1 512 1 32 1 512 1 32 1 2048 1 32 1 512 1 512 1 512 1 32 1 2048 Запропонований штам може бути використаний для виробництва вакцини проти некробактерюзу сільськогосподарських тварин Джерела інформації 1 Определитель бактерий Берджи /под ред Дж Хоулта, Н Крига, П Снита и др Перевод с англ акад РАН ГА Заварзина - 9-е изд в 2-х томах-1997-800с 2 А А Самоловов, С В Лопатин, В А Чурбанов, А В Киселев Конструирование и оценка вакцин для профилактики некробактериоза крупного рогатого скота // Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных Сб науч- тр-РАСХИ -Новосибирск,-1997 7 58875 С 108-113 3 Самоловов А А , Лопатин С В Некробактериоз крупного рогатого скота и пути решения проблемы //Аграрная Россия - 2001 -№3 -С 34-37 4 Федосеенко В А Усовершенствование Комп'ютерна верстка М Клюкін 8 средств специфической профилактики некробактериоза крупного рогатого скота и копытной гнили овец Автореф дис канд вет наук 16 00 03 Моек гос акад вет медицины и биотехнологии им К И Скрябина М-1998 -16 с Підписано до друку 05 09 2003 Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна