Вакцинний штам мyсовастеrіuм воvіs “м-україна”

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления противотуберкулезной вакцины у животных и человека, в практической работе бактериологических лабораторий и научноисследовательских институтах. Известный штамм W 115 - типичный Rвариант, на синтетических или яичных средах растет на 7 - 14 день при температуре 37°C. В мазках, окрашенных по Цилю - Нильсену, под микроскопом выглядит в виде длинных, тонких кислотоустойчивых палочек. Имеет интенсивную ниациновую реакцию, положительную нитратредуктазу и отрицательную пиразинамидазу. По антигенной структуре W 115 является идентичной культурой H37R v. Патогенный для морских свинок, белых мышей, кроликов и обезьян в дозах 0,001, 0,1, 0,5, 5, 10 и 20мг. Обладает меньшими иммунизирующими свойствами для морских свинок, чем вакцина БЦЖ. При этом эти свойства не стабильные (Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичных микобактерий. - Будапешт, 175. - С.153 - 154). Хорошо известен штамм БК-Харьков, полученный путем пассажа лабораторного штамма Vallee на среде с добавлением мутагена. По культуральным свойствам штамм БК-Харьков не отличается от исходного штамма Vallee. По морфологическим свойствам микобактерий БКХарьков слегка изогнутые, иногда с утолщениями на концах, полиморфные, окрашиваются в красный цвет по методу Циля - Нильсена, грамположительные палочки, размером 0,5 0,8мк. В цитоплазме бактерий выявляется зернистость, представленная фосфатными гранулами и вакуолями. Растет на элективных для микобактерий питательных средах в виде изолированных колоний в R-форме. На поверхности жидких сред вначале образует тонкую прозрачную, а затем рыхлую, морщинистую пленку светло-серого цвета или светло-желтого цвета при температуре 38°C. По биохимическим свойствам штамм является ниациноотрицательный. Имеет выраженную дегидрогеназную, нитразную, липазную, каталазную и пероксидазную активность. Непатогенный дли морских свинок, кроликов и мышей (Дикий И.Л. Основные свойства вакцинного штамма микобактерий туберкулеза "БК-Харьков" // Микробиологический журнал. - К.: Наук. думка, 1982. - Т.44. - №4. - С.48 - 51). Наиболее близким по техническому решению к заявляемому объекту является вакцинный штамм БЦЖ - типичный R-вариант, который на плотных яичных средах растет в виде плоских или розеткообразных колоний. На жидкой части среды Павловского дает рост в виде сухой с шероховатой поверхностью пленки. Из недостатков вакцинного штамма БЦЖ следует отметить, что он значительно ослабил первоначальное иммуногенное свойство, появились антибиотикорезистентные субштаммы, характеризующиеся антигенной и иммуногенной дефектностью. В национальных коллекциях отсутствуют субштаммы, обладающие иммуногенностью на уровне исходного штамма БЦЖ. Все это отрицательно влияет на эффективность профилактики туберкулеза с помощью вакцинного штамма БЦЖ. Кроме того, известные штаммы обладают сходными морфологическими, культуральными, тинкториальными и некоторыми биохимическими свойствами, но они не обладают высокими протективными свойствами. Задача изобретения - изыскание нового вакцинного штамма с более высокими иммуногенными свойствами, позволяющего защитить животных от туберкулезной инфекции. Поставленная задача решается использованием аттенуированного штамма бычьего вида "М-Украина" для приготовления противотуберкулезной вакцины. Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый штамм "М-Украина" отличается от известного вакцинного штамма БЦЖ, широко применяемого для специфической профилактики туберкулеза человека и животных, новым свойством - высокой протективной защитой, что соответствует критерию "Новизна". Это свойство не обнаружено при анализе других штаммов, что дает основание заявить о соответствии предлагаемого изобретения критерию "изобретательский уровень". Вакцинный штамм "М-Украина" получен из эпизоотической культуры возбудителя туберкулеза бычьего вида путем аттенуации патогенных свойств многократными пассажами на разработанной нами среде, содержащей различные концентрации эк-терицида. Исходный штамм выделен от убитой с диагностической целью коровы с характерными для туберкулеза изменениями в бронхиальных лимфатических узлах, реагировавшей на туберкулин. На основании изучения морфологических, культуральных и биологических свойств с использованием морских свинок и кроликов, выделенную культуру отнесли к возбудителю туберкулеза бычьего вида высокой вирулентности. Штамм "М-Украина" депонирован в коллекции микобактерий Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины под номером 175. Вакцинный штамм "М-Украина" №175 отнесен к порядку Actinomycetales, семейству Mycobacteriaceae, роду Mycobacterium, виду bovinus и характеризуется следующими морфологическими, культуральными, биохимическими признаками. Это кислотноспиртоустойчивые палочки, в среднем длина 1 2мк и ширина 0,2 - 0,3мк. В мазках, окрашенных по Цилю - Нильсену, выглядят в виде полиморфных палочек с закругленными краями, внутри выявляется зернистость, расположенных единично или кучками. Хорошо растет на яичных питательных средах, а также на усовершенствованной среде Павловского при температуре 38°C. На плотных яичных средах штамм растет в виде мелких, единичных или слившихся между собой колоний, возвышающихся над поверхностью среды светло-серого цвета в течение 20 - 30 дней. На картофельном клине среды Павловского штамм растет в виде круглых, слившихся колоний с гладкой поверхностью светло-серого цвета. На жидкой части среды образует тонкую серую пленку, которая при встряхивании легко тонет, образуя рыхлый осадок. Штамм имеет слабо выраженную каталазную и пероксидазную реакцию, положительную дегидрогеназную активность и отрицательные реакции с Твин-80 и теллуритом калия. При пятикратном пассаже на морских свинках у штамма не наблюдается реверсия к увеличению патогенных свойств. Штамм непатогенный для морских свинок при введении подкожно в дозах 5 и 10мг в см3, что отвечает требованиям инструкции МЗ СССР от 27.04.54г. применительно к противотуберкулезным вакцинам. Для изучения протективных свойств у штамма "М-Украина" отобрали 15 клинически здоровых отрицательно реагировавших на туберкулин морских свинок, которых разделили на три группы по 5 голов в каждой. Первая и вторая группы опытные, а третья -контрольная. Из культур "МУкраина" и БЦЖ, выращенных в течение 4 - х недель на модифицированной среде Павловского, делали взвеси на физрастворе, которые вводили первой группе штамм "М-Украина", а второй группе - вакцинный штамм БЦЖ в дозе 1мг/см3. Контрольную группу не прививали. Через 52 дня после прививки морских свинок всех трех групп заразили возбудителем туберкулеза бычьего вида (штамм "Крушинский") в дозе 0,00001мг/см3. По истечению 5 - ти месячного срока наблюдения всех опытных и контрольных животных подвергли диагностическому убою. Результаты сравнительного изучения протективных свойств у предлагаемого штамма "М-Украина" и вакцинного штамма БЦЖ (прототип) на морских свинках представлены в таблице. Сравнительный анализ полученных данных показал, что предлагаемый штамм обладает более высокими защитными свойствами, чем вакцинный штамм БЦЖ. В контрольной группе у морских свинок при вскрытии во внутренних органах выявили генерализованную форму туберкулеза. Таким образом, использование штамма "МУкраина" для приготовления противотуберкулезной вакцины позволит повысить эффективность специфической защиты против туберкулеза и животных и человека, снизить затраты на проведение профилактических мероприятий в хозяйствах, а также улучшит эпизоотическую ситуацию по туберкулезу в стране.