Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти (варіанти)

1 Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти, що включає промивання отриманої плацентарної тканини шляхом перфузування через пупкову вену фізіологічним розчином з антибіотиком, відокремлення від плаценти хоріону і амнютичної оболонки, а також значних кровоносних судин, подрібнення плацентарної тканини, розлив в пляшки, заморожування, сублімаційне сушіння з наступним досушуванням, який відрізняється тим, що отриману плацентарну тканину спочатку промивають стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком, потім здійснюють перфузію, після подрібнення плацентарну тканину гомогенізують у фізіологічному розчині до одержання сметаноподібної маси, до гомогенату додають 10-20% розчин диметилсульфоксиду на розчині Хенкса, перемішують, розливають у посудини, в яких формують шар гомогенату 15-20мм, який піддають сублімаційному сушінню, сублімаційне сушіння здійснюють протягом 15-35 годин, з наступним досушуванням при 28-35°С до остаточної вологості 5-15% 2 Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти, що включає промивання отриманої плацентарної тканини шляхом перфузування через пупкову вену фізіологічним розчином з антибіотиком, відокремлення від плаценти амнютичної оболонки, а також значних кровоносних судин, подрібнення плацентарної тканини, розлив в пляшки, заморожування, сублімаційне сушіння з наступним досушуванням, який відрізняється тим, що отриману плацентарну тканину спочатку промивають стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком, потім здійснюють перфузію, після подрібнення плацентарну тканину гомогенізують у фізіологічному розчині до одержання сметанообразної маси, до гомогенату додають 10-20% розчин диметилсульфоксиду на розчині Хенкса, перемішують, розливають у посудини, в яких формують шар гомогенату 15-20мм, який піддають сублімаційному сушінню, сублімаційне сушіння здійснюють протягом 15-35 годин, з наступним досушуванням при 28-35°С до остаточної вологості 5-15% 3 Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти за п 1, який відрізняється тим, що шар гомогенату 15-20мм формують шляхом обертання посудини з гомогенатом в горизонтальному положенні протягом періоду сублімаційного сушіння 4 Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти за п 1, який відрізняється тим, що плацентарну тканину отримують у породіль і жінок, що надійшли на добровільне переривання вагітності за показниками, сироватка крові яких дає негативний результат при тестуванні на гепатити В і С, вірус імунодефіциту, сифілісу, токсоплазмоз, цитомегаловірус, хламідм, мікоплазму, уреоплазму, краснуху, вірус простого герпесу 5 Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти за п 1, який відрізняється тим, що промивання плацентарної тканини стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком повторюють тричі 6 Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти за п 1, який відрізняється тим, що при подрібненні плацентарну тканину розрізають на окремі фрагменти розміром 3-5см, потім фрагменти плаценти подрібнюють у ножовому гомогенізаторі MPW-324, а потім у скляному гомогенізаторі Поттера 7 Спосіб одержання біологічно активного препарату з плаценти за п 1, який відрізняється тим, що 10-20% розчин диметилсульфоксиду на розчині Хенкса додають до гомогенату в співвідношенні 1 0,8-1,2 (О о> о о> ю 59096 Винахід відноситься до медицини і косметологи, а саме до створення імунобюлопчних препаратів і лікувально-профілактичних косметичних засобів Відомий спосіб отримання речовини, яка прискорює регенерацію тканин (дивись заявку на винахід Роси №92008683, МПК 6A01N1/02, дата публікації 1995 02 10), який передбачає подрібнення плацентарної тканини ссавців, обезжирювання ацетоном, змішування з еритроцитною масою, отриманою з цільної крови тварин у масовому співвідношенні 1 2-4, екстрагування суміші 0,10,5М розчином оцтової кислоти при 4-18°С на протязі 1-2 годин, потім відділення осаду, багаторазового промивання його водою, екстрагування 2-3 об'ємами 0,01-0,05%-ного розчину ферментного препарату еластолитина при 37-45°С, відділення екстракту і висушування сублімацією Отриманий за способом і висушений сублімацією екстракт не забезпечує повного вилучення імунобюлопчних речовин з плацентарної тканини Це знижує лікарські можливості препарату Значна частина імунобюлопчних речовин з плацентарної тканини залишається у відходах Відомий спосіб отримання гемостатичного матеріалу (дивись патент на винахід Роси №1432844, МПК 6A01N1/02, дата публікації 1996 01 20), який передбачає відділення у жіночої плаценти хоріону від амнютичної оболонки, подрібнення його на шматочки, які відмивають у фізіологічному розчині з антибіотиками, після бактеріологічного контролю тканини подрібнюють у подрібнювачі тканин РТ-1, подрібнену плацентарну масу заливають фізіологічним розчином з додаванням антибіотиків, віддалив консервант в асептичних умовах розливають подрібнену масу в градуйовані флакони ємністю ЮОмл і заморожують в морозильної камері, здійснюють сублімаційну сушку в апараті ТГ-15 (ГДР), на протязі 37±2 годин в умовах глибокого вакууму, потім досушують при температурі 33±2°С на протязі 6 годин Отриманий за способом препарат містить лише частину імунобюлопчних речовин які є в плацентарній тканини Значна частина імунобюлопчних речовин з плацентарної тканини залишаються у відходах Відсутність в препараті речовини, що покращує проникність біологічно активних складових препарату через КЛІТИННІ мембрани, зменшує лікарську дію препарату Спосіб складний у застосуванні тому, що при його реалізації потрібно працювати з великою КІЛЬКІСТЮ посуду з невеликою КІЛЬКІСТЮ препарату в кожної посудині Для реалізації способу потрібен великий об'єм морозильної камери та камери для сублімаційного сушіння Все це, а також подовжений період процесу сублімаційного висушування в умовах глибокого вакууму в свою чергу підвищує енергомісткість способу У деяких випадках використання препарату у вигляді порошку незручно непридатне Отриманий за способом препарат у відсутності консерванту має малий строк зберігання Завданням винаходу є створення способу одержання біологічно активного препарату з плаценти у якому шляхом зміни операцій способу та знайдених емпіричним шляхом режимів, використовуваної сировини, допоміжних речовин, обладнання, та дій з його використанням забезпечується збільшення виходу в способі препарату, збільшення періоду збереження та підвищення проникності біологічно активних речовин препарату через КЛІТКОВІ мембрани, що в цілому покращує ЯКІСНІ характеристики отримуваного препарату Ця задача вирішується тим, що в першому варіанті способу одержання біологічно активного препарату здійснюють промивання отриманої плацентарної тканини шляхом перфузування через пупкову вену фізіологічним розчином з антибіотиком, відокремлення від плаценти хоріону і амниотичної оболонки, а також значних кровоносних судин, подрібнення плацентарної тканини, розлив в пляшки, заморожування, сублімаційну сушку, з наступним досушуванням В другому варіанті способу одержання препарату здійснюють промивання отриманої плацентарної тканини шляхом перфузування через пупкову вену фізіологічним розчином з антибіотиком, відокремлення від плаценти амниотичної оболонки, а також значних кровоносних судин, подрібнення плацентарної тканини, розлив в пляшки, заморожування, сублімаційну сушку, з наступним досушуванням Новим в способі є те, що отриману плацентарну тканину спочатку промивають стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком, потім здійснюють перфузію, після подрібнення плацентарну тканину гомогенізують у фізіологічному розчині до одержання сметанообразної маси, до гомогената додають 10-20% розчин диметилсульфоксида (ДМСО) на розчині Хэнкса, перемішують, розливають у посудини, в яких формують шар гомогената 15-20мм, який підвергають сублімаційній сушці, сублімаційну сушку здійснюють протягом 15-35 годин, з наступним досушуванням при 28-35°С до остаточної вологості 5-15% Внаслідок застосування зазначених ознак способу збільшується частка плаценти, яка використовується в способі, внаслідок чого забезпечується збільшення виходу в способі препарату Використання при приготуванні препарату диметилсульфоксида, який є також консервант, забезпечує збільшення періоду збереження препарату Як показують результати ДОСЛІДІВ, залишення в препараті диметилсульфоксиду підвищує проникність біологічно активних речовин препарату через КЛІТКОВІ мембрани, що в цілому покращує ЯКІСНІ характеристики отримуваного препарату В конкретних застосуваннях способу одержання біологічно активного препарату з плаценти, шар гомогената 15-20мм формують шляхом обертання посудини з гомогенатом в горизонтальному положенні на протязі періоду сублімаційної сушки Внаслідок застосування зазначених ознак способу забезпечується можливість використовувати посудини більшого обсягу, що забезпечує можливість зменшити обсяг камери заморожування та сублімаційного сушіння До того ж внаслідок обертання посудини шар гомогената знаходиться в рухливому стані та з невеликою вібрацією, якою супроводжується обертання, внаслідок чого інтенсифікуються процеси заморожування та сублімаційного сушіння та зменшується їх тривалість В конкретних варіантах реалізації способу одержання біологічно активного препарату з плаценти плацентарну тканину отримують у породіль та жінок, що надійшли на добровільне переривання вагітності за показниками, сироватка крові яких дає негативний результат при тестуванні на гепатити В и С, вірус імунодефіциту, сифілісу, токсоплазмоз, цитомегаловирус, хламідм, мікоплазму, уреоплазму, краснуху, вірус простого герпесу Внаслідок використання зазначених ознак способу покращується якість отриманого препарату В конкретних варіантах реалізації способу одержання біологічно активного препарату з плаценти промивання плацентарної тканини стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком повторюють тричі Внаслідок цього на початковій стадії процесу забезпечується гарантоване очищення полупродукту від мікрофлори, що виключає можливість її розвитку на протязі здійснення способу, що також призводить до підвищення якості кінцевого продукту В конкретних варіантах реалізації способу одержання біологічно активного препарату з плаценти при подрібненні плацентарну тканину розрізають на окремі фрагменти розміром 3-5см, потім фрагменти плаценти подрібнюють у ножовому гомогенізаторі MPW-324, а потім у скляному гомогенізаторі Поттера Внаслідок використання зазначених ознак способу забезпечується рівномірна гомогенізація тканини що додатково покращує наступний процес дифузії диметилсульфоксида в клітини тканини, внаслідок чого всі клітини отримують достатню КІЛЬКІСТЬ диметилсульфоксида і внаслідок цього КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин підвищується В конкретних варіантах реалізації способу одержання біологічно активного препарату з плаценти 10-20% розчин диметилсульфоксида на розчині Хэнкса додають до гомогената в співвідношенні 1 0,8-1,2 Запропонований інтервал співвідношення гомогената до розчину диметилсульфоксида на розчині Хэнкса, оснований на отриманих імперічних даних і забезпечує оптимальні умови для початку наступного процесу замороження, а також необхідну КІЛЬКІСТЬ диметилсульфоксида для покращення процесу проникнення біологічно активних речовин препарату через КЛІТКОВІ мембрани Для порівняння прототипу та запропонованого способу здійснювали спосіб за прототипом та запропонований на зазначених нижче прикладах В прикладах здійснювали такі дії Для приготування препарату за прототипом та запропонованим способом використовували плацентарну тканину, отриману в породілей і жінок, що надійшли на добровільне переривання вагітності за показниками, сироватка крові яких дає негативний результат при тестуванні на гепатити В и С, вірус імунодефіциту, сифілісу, токсоплазмоз, цитомегаловірус, хламідм, микоплазму, уреоплаз 59096 му, краснуху, вірус простого герпесу За відомим способом отримання гемостатического матеріалу ВІДДІЛЯЛИ у жіночої плаценти хоріон від амнютичної оболонки, подрібнювали його на шматочки, які відмивали у фізіологічному розчині з антибіотиками, після бактеріологічного контролю тканини подрібнювали у подрібнювачі тканин РТ-1, подрібнену плацентарну масу заливали фізіологічним розчином з додаванням антибіотиків, віддалив консервант в асептичних умовах розливали подрібнену масу в градуйовані флакони ємністю ЮОмл і заморожували в морозильної камері до -30°С, здійснювали сублімаційну сушку в апараті ТГ-15 (ГДР), на протязі 38 годин в умовах глибокого вакууму, потім досушували при температурі 34°С на протязі 6 годин Матеріал зберігали протягом одного місяця в холодильнику В прикладах 1-14 за запропонованим способом плацентарна тканина, отримана під час родів, зроблених за допомогою кесарева перетину, або простагландинового переривання вагітності за показниками, тричі промивалася стерильним фізіологічним розчином з антибіотиком (канаміцин 30ед/мл) В прикладах 1-7 в асептичних умовах робили відділення плаценти від хоріона й амнютичної оболонки, а також від значних кровоносних судин В прикладах 8-14 в асептичних умовах робили відділення плаценти від амнютичної оболонки, а також від значних кровоносних судин Очищену прикладах 1-14 плацентарну тканину ще раз промивали за допомогою перфузм стерильним фізіологічним розчином через пупочний канатик, після чого розрізали на окремі фрагменти розміром 3-5см Фрагменти плацентарної тканини подрібнювали у ножовому гомогенізаторі MPW-324, а потім у скляному гомогенізаторі Поттера у фізіологічному розчині до одержання сметанообразної маси До гомогената в співвідношенні 1 1 додавали 10-20% диметилсульфоксида (ДМСО) на розчині Хэнкса, перемішували, розливали у скляні пляшки обсягом 50-500мл Пляшки з гомогенатом для забезпечення заморожування та наступного сублімаційного сушіння встановлювали в камеру апарата ОСС-25 УЗВ-1 виробництва СКТБ з ОП при Харьковському інституті проблем кріобюлопі та крюмедицини НАН України У Таблиці 1 зазначені режими виконання запропонованого способу, а в Таблиці 2 подані результати, отримані при порівняльному дослідженні препаратів, отриманих по режиму, описаному в прототипі і по запропонованому способу (в прикладах 1-14) В таблицях 3 та 4 подані результати, які свідчать про проникність через КЛІТКОВІ мембрани препаратів, отриманих по режиму, описаному в прототипі і по варіантах запропонованого способу (в прикладах 1-14) Проникність через КЛІТКОВІ мембрани визначали у дослідах на моделі, за якими відокремлювали амнютичну оболонку, вирізували з неї однакові фрагменти розміром бхбсм, промивали фрагменти у фізіологічному розчині 3 рази, з кожного шматочка формували мішечок, який у верхній частині зав'язували кетгутом, через отвір у верхній частині шприцом уводили 20мл розчину плацентарної су 59096 спензм отриманої у прототипі та в прикладах 1-14 (тобто сублімованої з ДМСО і без ДМСО), мішечки опускали в стаканчики з фізіологічним розчином, через 1 годину (табл 3) і 3 години (табл 4) фізіологічний розчин зливали й у складі цього розчину визначали наявність гормонів По КІЛЬКОСТІ гормонів у фізіологічному розчині судили про проникність препарату через КЛІТКОВІ мембрани Гормони визначали за допомогою імуноферментного аналізу з використанням тест систем фірми Amersham Як видно з поданих у таблицях 2 результатів, ЦІЛІСТЬ гормонів і білків у препаратах плаценти, отриманих запропонованим способом, та проникність препарату через КЛІТКОВІ мембрани (Таблиці З, 4), набагато вище, чим в отриманих за прототипом Використання ознак запропонованого способу забезпечує збільшення виходу в способі препарату, збільшення періоду збереження, та підвищення проникності біологічно активних речовин через КЛІТКОВІ мембрани, що в цілому покращує ЯКІСНІ характеристики отримуваного препарату Таблица 2 дн Пак™ І г 35 1!^ 13,1 «в Э2Й згл 4 1*1 іаі « « 34 141 T4J 134 Об 450 52ЇЯ 4? 79« 41 Є8 4 3 4 ч ь т a 9 Ю 11 і: 13 Id IW ал 14 ІЗ,» у,: US II 1 ш 316 мо 326 1! 10,! 8,4 10,1 34 1SJ 141 І2Я Ш ^220 53*ї K7S 512U «5,S 66,3 75 70 й «Т Я19 SS7 34 Фоямкуло Препаїпін Прогестерон Н ПКСЛЬ㥲 Кортизон ігмз/іь/іт іг і 39* » из S 42 Уз s,* Рї ЇМ 5»S4 521? « Ы 63,4 SS,5 Ж! ЯЗІ 197 Я Ж (7,1 893 s w НГЙЫ1 ш 67 7 ІЗЇ » ^ ^ 141 ЧИ» "1)6 64* йй,ч 809 3238 МІЧ 32JS Таблица 1 о. 1 0. 2 І s * 1 s х Т С м ї ID 3 Ч l | l я ЦІ X 3 як U °С s о. і га 1 1 і Температура 1 ї » 3S67 і!* 3411 3200 J4IJ ЗЗЕ4 7".3 ферінльнссті і =г -,, 4367 зчзз 4022 «1* п» -. JJ211 3 . , Tfi.i 3S!9 711 7S4 ЙТИ 71,4 1 5 И 1 3x5 20 1 08 20 13,2 2 3x4 18 1 1,1 17 3 3x3 18 1 0 8 14 о« 31 33 16,0 28,5 ЛН1 5,7 J433 4ОЇЗ 45110 4277 358* 358? 12,1 27,8 4177 9,3 35 17,5 — 15,5 Лої' Таблиця З и клади Показник 4 3x5 20 1 1,2 15 26,4 17,0 2Э 6,4 S 3x3 15 10,9 12 16 4 15,5 29,5 7,1 18 1 08 13 30,8 16,5 ЗО 7,9 16 10,9 10 23,6 17,0 30,5 8,6 Є 7 3x4 Z7 1 м S S І 3 7Ї « 7S 7 72 55 S 1 1(1 кг 75 105 11 ІЗ Ы 58 It US й __ 117 ІГ —— a. 3x5 21 1 1 2 9 3x4 1. 1-Ю 11 33,6 18,5 31,5 10 1Є 3x3 17 1 11 16 2Э2 18,0 32 10,7 11 3x5 20 1 1,2 20 гг,2 17,5 32,5 11,4 12 4x3 19 1 1,0 10 178 19 33,5 12.9 13 3x5 16 11,1 1Э 25 19,5 34 13,6 14 3x3 17 1 a,9 12 21 20 35 15 18 13,5 32 2 34,5 14,3 Хорюннч вий 1 пя 8 102 106 1 Ой (!й Ш, 142 llfi Ї6 ,« Таблица А Прима ои s Показира 1 Пролакгн мєда Естрадіо/т ний Комп'ютерна верстка Е Гапоненко 13 г І 27 ш 4 S 13 1 • 113 Я 109 93 Ш 113 11 іг и 14 127 st І її SI 531 5 4 4 =7 3U 3 J78 2J * S J« 488 1Ї9 256 МІ Підписано до друку 05 09 2003 №1 310 !JS Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна 278 2JS