Спосіб виготовлення вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби “триховак”

Спосіб виготовлення вакцини проти трихофітії великої рогатої худоби, що включає посів і вирощування культури гриба Trichophyton verrucosum TФ-130, який відрізняється тим, що культури з живильного середовища гомогенізують і доводять 3 концентрацію мікроконідій до 6-12 млн./см , заморожують та ліофілізують з захисним середовищем. (19) (21) u201010853 (22) 09.09.2010 (24) 10.06.2011 (46) 10.06.2011, Бюл.№ 11, 2011 р. (72) НЕСТЕРЕНКО ТЕТЯНА ГРИГОРІВНА (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "АЛТЕКС" 3 сифон у матрицю і засівають нові матри із суслоагаром. На кожному матраці відмічають номер штаму і дату засіву. Кількість засіяних матраців визначають об'ємом випуску на даному підприємстві. Засіяні матраци ставлять у термостат у напівпохилому або горизонтальному положенні (живильним середовищем до верху) і витримують при температурі 26-28 °С. Враховуючи вплив пори року на енергію росту термін вирощування культури може коливатися в межах 11-15 діб. Помітний ріст на сусло-агарі з'являється на 3-5 добу. Культура повинна покривати всю поверхню сусло-агару рівною білуватою злегка порошистою плівкою. В процесі вирощування матраців із культурою Trichophyton verrucosum візуально переглядають, починаючи із 2-го дня через кожні 2-і доби, на наявність сторонніх забруднень. При бактеріальному або грибковому забрудненні матраци бракують і негайно автоклавують при 2 атм. 1-ну годину. Культура ТФ-130 у матрацах для виробничої мети може зберігатись в холодильнику при температурі 2-6 °С не більше 10 днів. Приготування живильного середовища: Живильним середовищем для вирощення культури гриба виробничого штаму Trichophyton verrucosum є сусло-агар. Для одержання суслоагару використовують пивне неохмелене сусло (14-18 % за Баллінгом). Простеризоване пивне сусло зберігають до 30 днів у чистому приміщенні при температурі 2-8 °С. Пивне сусло розбавляють водою - водогінною або дистильованою до отримання 8-9 % вуглеводів за Баллінгом, заливають у варильний котел і до стерилізації встановлюють рН 7,0-7,4, потім додають агар-агар (мікробіологічний, ГОСТ 17206-71), кип'ятять до розчинення агару, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у матраци і в пробірки. Сусло-агар після стерилізації для контролю стерильності живильного середовища витримують 2-3 доби в термостаті при температурі 26 і 37 °С. Після витримки в термостаті, матраци з живильним середовищем ретельно продивляються на чистоту. Виготовлення захисного середовища: Як захисне середовище (середовище висушування) використовують 10 % стерильний водний розчин цукрози (ГОСТ 5833-75) і 2 % желатину харчового (ГОСТ 23058-78). Для виготовлення середовища в гарячу дистильовану воду додають желатин у розрахунку 2 % від маси і після його розчинення цукрозу з розрахунку 10 % від маси на взятий об'єм води і фільтрують. Стерилізують середовище при 1 атмосфері 1 годину. Зберігають готове середовище в холодильнику при температурі 2-10 °С не більше 15 діб. Захисне середовище перевіряють на стерильність. Для цього беруть пробу середовища і по 1-2 краплі висівають у пробірки з МПА, МПБ, КіттТароцці, агар Сабуро та сусло-агаром. Посіви на МПА, МПБ, Кітт-Тароцці витримують у термостаті при температурі 37 °С протягом 10 діб. На 5 добу культивування із середовища МПА і Кітт-Тароцці проводять пересіви на ті ж середовища і витримують 5 діб. Посіви повинні бути чистими і не давати 59898 4 росту сторонньої мікрофлори. Знімання вирощеної культури з живильного середовища: Матраци з культурою Trichophyton verrucosum заздалегідь протирають спиртом, потім відкривають над палаючими спиртівками. Спеціальним шкребком знімають грибну масу з поверхні сусло-агару і з дотриманням стерильності розміщують її в стерильні банки з кришками для подальшого подрібнення в гомогенізатори (міксери) або колоїдному млині. Для знімання грибної маси з поверхні суслоагару застосовують шкребок у вигляді Г-подібної металевої пластинки, нижня ріжуча частина якої дещо скошена і гостро заточена. Вказана пластинка (довжиною 2 см і шириною 1 см) припаюється до металевої ручки довжиною 40 см, діаметром 810 мм. Знімання грибної маси потрібно здійснювати не зачіпаючи живильного середовища. Подрібнення (гомогенізація) грибної маси і визначення в ній концентрації мікроконідій: Розмелюють грибну масу в гомогенізаторах (міксерах) різних марок або колоїдних млинах (типи 1V-8, 1V-10) при умові забезпечення в період роботи повної стерильності. Протягом всього часу завантаження, подрібнення і розвантаження біомаси температура в робочих камерах (ємностях, де подрібнюється і циркулює біомаса) гомогенізаторів і колоїдних млинів різних типів неповинна бути вище 30 °С. У міксер (Чеський марки ЕТА МІРА) завантажують з дотриманням стерильності грибну масу з 3 4-5 матраців, заливають 300 см стерильної води і прикривають щільно кришкою. Для подрібнення знятої із сусло-агару маси можуть бути використані колоїдні млини з внесеними доповненнями в їх конструкцію. Основним доповненням є закритий бункер, виготовлений із сталі, що не ржавіє. Перед початком роботи знімальний бункер приєднується до колоїдного млина. Один із штуцерів бункеру за допомогою вакуумної трубки через трійник з'єднується вихідним патрубком колоїдного млина і стерильним бутлем (через короткий сифон), другий із системою стиснутого повітря без сторонньої мікрофлори. В бункер вмикають систему подачі стерильного повітря, що дозволяє в момент завантаження грибної маси підтримувати в бункері підвищений тиск. Через люк у бункер завантажують грибну масу і доливають стерильної води. При розмелюванні дозволяється додавання антибіотиків пеніциліну та стрептоміцину з розрахунку по 100 тисяч одиниць кожного на 1 літр одержаної суспензії. Завантажувальний люк бункера герметично закривають, припиняють подачу стерильного повітря, регулюючим пристроєм ножі встановлюють на нульову позначку, потім вмикають колоїдний млин і розмелюють грибну масу. У цей період суспензія (концентрат) грибної маси циркулює по замкнутій системі (із бункера в колоїдний млин і через вакуумну трубку знову в бункер і т.д.). Для виключення попадання суспензії в балон вакуумна трубка, яка з'єднує трійник з балоном, закривається затискачем. 5 По закінченню вказаного часу роботи колоїдного млина вакуумну трубку, яка з'єднує бункер з вихідним патрубком млина, перетискають затискачем, а затискачі із зливної трубки знімають. При цьому грибна маса переміщується в бутель. Перекачка грибної маси в бутель здійснюється при увімкненому млині з одночасною подачею стерильного повітря в бункер. Подрібнена грибна маса надходить в бутель, який має два сифони (довгий та короткий), вмонтований в пробку. Короткий сифон служить для прийому грибної маси в бутель із млина, а також для утворення підвищеного тиску в момент злиття вмісту. До зовнішнього кінця довгого сифону приєднується 1,5-2 метрової довжини гумова трубка, через яку береться проба для перевірки на стерильність. Із одержаної після розмелювання концентрованої грибної маси, з дотриманням умов стерильності, беруть пробу для проведення цехового контролю: визначають концентрацію грибної маси і кількість мікроконідій, а також перевіряють на відсутність росту сторонньої мікрофлори. Концентрат грибної маси відразу після розмелювання розміщують у холодильнику при температурі 2-6 °С і після одержання результатів контролю, але не пізніше, ніж на 8 день з дня розмелювання, використовують для виготовлення початкової суспензії для сушіння шляхом змішування з захисним середовищем. Визначення концентрації грибної маси проводять по бактеріальному оптичному стандарту каламутності (БОСМ), кількість грибних клітин (мікроконідій) визначають методом підрахунку в камері Горєва для підрахунку формених елементів в крові. Проводять перевірку на чистоту (відсутність росту сторонньої мікрофлори). Змішування гомогената з захисним середовищем: Після визначення концентрації мікроконідій в грибній масі і перевірки її чистоти, роблять розмішування гомогенату з захисним середовищем. Для цього бутель з гомогенатом за допомогою стерильного шланга приєднують до другого стерильного бутля, куди перекачують гомогенат. Всі роботи виконують у стерильному боксі при температурі не більше 25 °С. Розливання у флакони: Бутель із сумішшю встановлюють в бутельапарат і ретельно перемішують вміст. Потім при періодичному помішуванні проводять розливання гомогенату. Вакцину фасують у стерильні флакони з скло дроту за ТУ 64-2-10-87 при допомозі приєднаних до бутля бюреток або іншої дозувальної апаратури, яка забезпечує стерильне розливання. 3 Вакцину фасують по 40 доз (10,0 см ), 20 доз 3 3 3 (5,0 см ), 10 доз (2,5 см ) та 2 дози (2,0 см ). Похи3 бка фасування по 5-10 см складає 0,5 %. Флакони з вакциною ставлять у касети під стерильну двошарову марлеву серветку. Заморожування: Касети з матеріалом негайно після розливання розмішують у охолодженому до температури мінус 59898 6 40-50 °С камеру холодильника. І проморожують при цій температурі 8-16 годин. У 2-3 флакони з вакциною в різних касетах встановлюють 2-3 датчики для знімання під час сублімації показників температури продукту. Касети з замороженою вакциною швидко перевантажують у підготовленуі охолоджену, підключають датчики, закривають дверцята і вмикають вакуумні насоси. Висушування (ліофілізація) гомогената з захисним середовищем: При досягненні показників вакууму 9-10 атм, вмикають нагрівання полиць. Нагрівання підтримують до досягнення температури вакцини мінус 8-10 °С, а потім знижують нагрівання полиць до 25 °С і витримують до закінчення сушки. Після завершення сушіння камеру через спеціальний фільтр заповнюють стерильним сухим повітрям або інертним газом. Касети закриті марлевими серветками переносять в бокс. Флакони над спиртівками закривають стерильними гумовими пробками за ТУ 33006-108-84 і закатують алюмінієвими ковпачками за ГОСТ 64-7-85-79 і етикують. Зберігають вакцину при температурі 2-3 °С. Приклад 2. Вакцина проти трихофітії великої рогатої худоби "Триховак" до складу, якої входить штам Trichophyton verrucosum ТФ-130 готують по прикладу 1. Імуногенну активність вакцини перевіряли на 20 здорових морських свинках масою 330350 г. та на 12 коровах віком від 3 місяців до 2 років. Вакцину ресуспензували стерильним розчин3 ником з розрахунку 2 см розчинника на 1 комерційну дозу вакцини, і ввели внутрішньом'язево із 3 зовнішнього боку стегна в об'ємі 0,4 см десятьом морським свинкам. Через 10-14 діб провели другу вакцинацію у тій самій дозі в стегно другої кінцівки. Для контролю використали 10 не вакцинованих морських свинок. Через 20 діб після другої ін'єкції імунізованих та контрольних тварин заразили нашкірним методом вірулентною культурою 6 Trichophyton verrucosum ТФ-153 у дозі 5 х 10 мік3 роконідій в 1 см в попереково-крижову ділянку. Шерсть на місці зараження попередньо вищипали на площі 3x3 см і шкіру скарифікували лезом скальпеля. За тваринами вели спостереження протягом 25 діб. В імунізованих тварин відмічався ріст волосся, ураження відсутнє. У контрольних тварин гіперемія, поширення ураження, кірки. У контрольних тварин відмічалось захворювання, а імунізовані залишались здоровими. Вакцина "Триховак" витримала випробування щодо імуногенної активності на лабораторних тваринах. Приклад 3. Вакцина проти трихофітії великої рогатої худоби "Триховак" до складу, якої входить штам Trichophyton verrucosum ТФ-130 готують по прикладу 1. На 25 добу після зараження 6 імунізованих і 6 не імунізованих (контроль) корів заражених вірулентним штамами Trichophyton verrucosum ТФ-153. Грибну суспензію (гомогенат) штаму у дозі 6 3 2,5 х 10 мікроконідій/см втирали на попередньо вистрижену і скарифіковану шкіру розміром 3 х 3 7 59898 см за лопатками. У вакцинованих корів, яких заразили вірулентним штамом відмічали ріст волосся, ураження відсутнє. У контрольних не щеплених корів, яких заразили тим самим штамом відмічали незначне Комп’ютерна верстка А. Крулевський 8 поширення ураження за межі ділянки зараження, гіперемію, кірочки. Вакцина "Триховак" витримала випробування щодо імуногенної активності на сприйнятливих тваринах. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601