Спосіб одержання антигенного ешерихіозного еритроцитарного діагностикуму

Спосіб одержання антигенного ешерихіозного еритроцитарного діагностикуму, що полягає у естракції антигенів ешерихій, їх інактивації, сенсибілізації еритроцитів та приготуванні діагностикуму, 3 екстракції супернатант прогрівали при +6568ºС та сумішшю цих антигенів проводили сенсибілізацію еритроцитів коня оброблених таніном та формаліном. Недоліком прототипу є застосування як антигену суміші адгезинів кишкових паличок невизначених сероварів, що не дає перспективи використання препарату для поглибленого визначення збудника інфекції при спалахах ентероколіту у людей та при розслідуванні епізоотій колібактеріозу серед птахів. Поставлено задачу розробити спосіб одержання більш специфічного діагностикуму, що давав би можливість ідентифікувати збудника інфекції виявленням антитіл у сироватках людей та птахів на ранніх стадіях захворювання, спричинених високопатогенними ентероінвазивними кишковими паличками Е.соlі 0151 "Крим" [7,8], що мають епідемічне та епіозоотичне розповсюдження. Задача вирішувалась тим, що виготовляли суспензію ентероінвазивного, високотоксигенного штаму кишечної палички 0151 "Крим", здійснювали дезінтеграцію клітин замороженнямрозмороженням. Антиген екстрагували у вигляді поліпептидного комплексу гіпертонічним розчином хлористого натрію двічі, осаджували сульфатом амонію. Після діалізної очистки одержаного продукту, висушували ліофілізацією. Окремо підготовляли еритроцити барана із застосуванням розчину глюгіциру, після чого еритроцити сенсибілізували формаліном та навантажували антигеном. Витримували добу, у термостаті, визначали специфічну активність діагностикуму. При вирішенні поставленої задачі (виготовлення антигену) враховували наступні підходи: вирощування бактеріальної маси, одержання поліпептидного комплексу, одержання еритроцитів барана та підвищення сенсибілізуючої активності еритроцитів, об'єднання поліпептидного комплексного антигену (сенситину) із сенсибілізованими еритроцитами. Ешерихіозний антиген готують із ізольованого нами штаму ентероінвазивної кишкової палички Escherichia coli (EIEC) 0151 "Крим" біовар 2, що має всі характерні властивості для ентероінвазивних вірулентних штамів, викликає загибель білих мишей при внутрішньочеревному введенні 500 тис. мікробних клітин 18-годинної агарової культури. У штамі Escherichia coli (EIEC) 0151 "Крим" встановлено наявність 5 біотипів, що різняться за їх здатністю до утворення газу (також відсутність газоутворення у глюкозі), ферментацією арабінози, сорбіту, дульциту, декарбоксиліруванні лізину та орнітину. Штам Escherichia coli (EIEC) 0151 "Крим" біовар 2 має біохімічну активність характерну для 2-го біовару та має спільний О антиген з іншими 3 біоварами чітко аглютинується специфічною діагностичною сироваткою в реакції аглютинації [7]. Поліпептидний комплекс одержують наступним чином. Нарощують бактеріальну масу на щільному середовищі та змивають фізіологічним розчином. Концентрують мікроорганізми центрифугуванням при 5000 об/хв. - 20-30 хв. Осад використовують для одержання антигену. 63003 4 Бактеріальну масу заморожують при -80 °C та швидко розморожують. Екстрагують поліпептиди 2,02,5 % розчином хлориду натрію при +4042 °C 30-40 хв., центрифугують екстракт при 10000 об/хв.. - 30 хв. для відділення надосадової рідини від осаду. До надосадової рідини добавляємо сульфат амонію. Осад, що утворився, діалізуємо проти дистильованої води. Таким же чином обробляють осад бактеріальної маси повторно. Поліпептидні антигени, одержані при першій та другій обробці та після концентрації сульфатом амонію та діалізу проти дистильованої води, об'єднують в один антиген, ліофільно висушують, дозовану кількість розчиняють у фосфатнобуферному розчині перед нанесенням (навантаженням) на оброблені формаліном еритроцити барана. Проведення дезінтеграції бактерійної маси шляхом глибокого заморожування з наступною екструзією реалізує оптимальні умови вивільнення антигенних комплексів та збереження їх нативності, що забезпечує підвищення специфічної активності антигенів. Дворазова екстракція осаду 2,5 % розчином хлориду натрію та ізоляція другого суіернатанту дозволяє підвищувати вихід поліпептидного комплексного антигену та зниження його собівартості. Антигени об'єднують в один препарат, стерилізацію здійснюють фільтрацією та ліофільно висушують. Фракціювання антигенів із супернатантів сульфатом амонію, крім ефекту концентрації та очистки, має одну важливу перевагу у порівнянні із іншими методами, а саме стабілізує білки; суспензія білкового осаду в 2-3 М розчині сульфату амонію стабільна впродовж багатьох років. Порівняльне вивчення білкових фракцій кишкових бактерій, одержаних водносольовою екстракцією (NaCl) та ізольованих обробкою трихлороцтовою кислотою показало, що білкові фракції більш активні, ніж ліпополісахариди. Результати досліджень свідчать про те, що білкові компоненти бактеріальних клітин в більшості визначають їх серологічну специфічність та імунологічну активність [9, 10]. Кров для одержання еритроцитарної маси відбирають при промисловому забою тварин або у живих із яремної вени, в ємкості зі стерильним розчином глюгіциру [11]. Застосування розчину глюгіциру дозволяє зберігати еритроцити неушкодженими в 85-90 % без утворення грудочок, аутоаглютинатів. Еритроцити осаджують центрифугуванням при 3000 об/хв., відмивають стерильним фосфатно-буферним розчином від глюгіциру - 20 хв. при 2000 об/хв. Для підвищення чутливості еритроцити обробляють розчином формаліну [12]. Нанесення антигену - поліпептидного комплексу (сенситину) на еритроцити барана проводять наступним чином: осад еритроцитів розводять забуференим фізіологічним формальдегідом до 10 % концентрації, витримують добу при +37 °C та навантажують сенситин, витримують у термостаті 18-20 годин. Фасують препарат у флакони ємкістю 10-12 мл та ліофільно висушують. Контролюють на активність, специфічність, визначають концентрацію еритроцитів та рН. Проводять ліофільне висушу 5 63003 вання та контролюють специфічну активність готового препарату. Метод за його простотою та економічністю доцільно використовувати у промисловому виробництві. Активність еритроцитарного антигену визначали в РНГА в полістиролових планшетах для мікротитрування із розведеною специфічною сироваткою, визначали активність діагностикуму за титрами антитіл у сироватці за допомогою стереоскопічного мікроскопа МБС-1 (реакція має бути позитивною до кінцевого титру діагностичної сироватки а також із сироватками перехворілих на ешерихіоз, спричинених Escherichia coli (EIEC) 0151 "Крим". Специфічність визначали в РНГА із сироватками що мають антитіла до інших сероварів кишкових паличок сироватками з антитілами та з нормальними сироватками кролів (антигенний діагностикум не має вступати в реакцію з гетерологічними сироватками та аглютинуватися нормальною сироваткою кролів). Приклад 1 Ешерихіозний антиген готують із штаму ентероінвазивної кишкової палички Escherichia coli (EIEC) 0151 "Крим" біовар 2. Бактеріальну масу нарощують на щільному середовищі, готують суспензію, змиваючи фізіологічним розчином. Концентрують мікроорганізми центрифугуванням при 5000 об/хв. 25 хв. Бактеріальну масу осаду заморожують при -80 °C, швидко розморожують. Екст 6 рагують поліпептиди 2,5 % розчином хлориду натрію при +40 °C 35 хв. Екстракт центрифугують на 10000 об/хв. впродовж 30 хв. До надосадової рідини добавляють 2,5М розчин сульфату амонію. Осад діалізують проти дистильованої води. Таким же чином обробляють осад бактеріальної маси ще раз. Поліпептидні антигени, одержані за першої та другої обробки, об'єднують в один антиген, ліофілізують. Кров барана додають у ємкість із стерильним розчином глюгіциру. Еритроцити центрифугують на 3000 об/хв., відмивають стерильним фосфатно-буферним розчином від глюгіциру на 2000 об/хв. впродовж 20 хвилин. Одержані антигени розчиняють у фосфатно-буферному розчині. Осад еритроцитів розводять забуференим фізіологічним формальдегідом до 10 % концентрації, витримують добу при +37 °C та навантажують одержаний антиген. Витримують у термостаті 20 годин. Фасують препарат у флакони, ліофільно висушують. Проводять ліофільне висушування та контролюють специфічну активність готового препарату. Одержаний антигенний еритроцитарних діагностикум на основі культури Е.соlі О151 "Крим" перевіряли на 34 сироватках крові підлітків, що перехворіли на ентероколіт, спричинений Е.соlі О151 "Крим". Визначали рівень М та G-антитіл в двох реакціях: в реакції аглютинації (РА) та РНГА з антигенним еритроцитарним діагностикумом Е.соlі О151 "Крим". Результати наведені в Таблиці. Таблиця Серологічне обстеження хворих на ентероколіт Кількість обсте- Обстежені бакте- Ізольовані куль- Не обстежені Наявність Мтав- Максимальні титри анантитіл титіл жених серологіч- ріологічним метури Е.соlі бактеріол. меним методом тодом О151"Крим" тодом РА РНГА РА РНГА 11 11 11 11 11 1:800 1:1600 23 23 13 23 1:400-1:800 1:1600 Всього 34 11 11 23 34 34 1:400-1:800 1:1600 Наведені в Таблиці результати свідчать про високу чутливість антигенного ешерихіозного діагностикуму на основі Е.соіі О151 "Крим", можливість виявляти наявність специфічних антитіл у сироватках підлітків без проведення бактеріологічного обстеження (наявність G-антитіл свідчить про перенесене захворювання в осередку спалаху інфекції та про високу чутливість діагностикуму) та про можливість підтверждення захворювання на основі одержаних серологічних результатів. Джерела інформації: 1. Инструкция по применению диагностикумов эритроцитарных шигеллезных; дизентерии 1,2; флекснера 1-5; флекснера 6 и зонне антигенных жидких и сухих. Утвержденная Министерством здравоохранения РСФСР от 24 февраля 1987 г., стр. 1-4. 2. Диагностикумы сальмонеллезные эритроцитарные 0- антигенные жидкие суспензия для диагностических целей. 3. Леви М. И., Кравцов Ф.Е., Басова Н.Н. МРТУ-4213-67 по изготовлению дифтерийного эритроцитарного антигенного диагностикума. Утв. КВС МЗ СССР 05.03.1967. 4. Леви М. И., Фоменко Г.А., Басова Н.Н. МРТУ-4212-67 по изготовлению столбнячного эритроцитарного антигенного диагностикума 15-67. Утв. КВС МЗ СССР 05.03.1967. 5. Патент України №75823 "Спосіб одержання імунної плазми проти грамнегативних бактерій" 6. Патент RU №2353388 Способ получения антигенного эшерихиозного эритроцитарного диагностикума. 7. Савченко Б. І., Хабло З. А. Патент на корисну модель №43125 "Штам ентероінвазивної кишкової палички Escherichia coli0151 "Крим" біовар 2 (ЕІЕС) №818 для одержання діагностичної сироватки". 8.Савченко Б. І. Патент на корисну модель №46088 "Штам ентероінвазивної кишкової палички Escherichia coli O151 "Крим" біовар 4 (ЕІЕС) № 808 для одержання профілактичної вакцини". 7 9. Тимаков В. Д., Скавронская А. Г. Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии (ЖМЭИ).-1961. - N3. - C.3-9 10. Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1985, с 40. 11. Бощенко Ю. А., Савченко Б. І., Юрданова А. М., Маньковська Н. М Патент на корисну мо Комп’ютерна верстка М. Ломалова 63003 8 дель №6952 від 15.09.2004 г. Спосіб одержання еритроцитарної маси для приготування діагностичних препаратів. 12. Каральник Б. В. Эритроцитарные диагностикумы. М.: Медицина, 1976, с 88; 105. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601