Спосіб отримання штамів streptomyces nogalater з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину

Спосіб отримання штамів Streptomyces nogalater з підвищеним рівнем біосинтезу ногаламіцину, який базується на уведенні додаткових копій регуляторного гена, який відрізняється тим, що як регуляторний ген використовують клонований у складі інтегративної кон'югативної плазміди pR3A та автономної кон'югативної плазміди pSOKA ген snorA, продуктом якого є активатор транскрипції структурних генів біосинтезу ногаламіцину. (19) (21) u201102650 (22) 09.03.2011 (24) 25.10.2011 (46) 25.10.2011, Бюл.№ 20, 2011 р. (72) КЛИМИШИН ДМИТРО ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ФЕДОРЕНКО ВІКТОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ГРОМИКО ОЛЕКСАНДР МИКОЛАЙОВИЧ, ГРЕНЬ ТЕТЯНА ПЕТРІВНА, НІМЕЦЬ ОКСАНА ЯРОСЛАВІВНА (73) ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА, ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ 3 кокопійній плазміді pSOK101 - у 10-14 разів. Однак, цей спосіб не може бути застосований щодо штамів S. nogalater, оскільки інтегративна плазміда pSET152 не підтримується у клітинах продуцента ногаламіцину через відсутність сайтів її інтеграції в хромосомі S. nogalater [Климишин Д.О., Громико О.М., Федоренко В.О. Використання міжродової кон'югації Escherichia coli-Streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам Streptomyces nogalater IMET 43360 // Цитол. и генет. - 2007. - Т.41, №5. - С. 263-267]. Використати ген Indl, для отримання штамів з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину також неможливо через те, що його продукт специфічний лише щодо генів, які контролюють біосинтез ландоміцинів і не здатен активувати транскрипцію структурних генів біосинтезу інших антибіотиків [Rebets Y., Dutko L., Ostash В., Luzhetskyy A., Kulachkovskyy O., Yamaguchi Т., Nakamura Т., Bechthold A., Fedorenko V. Function of lanl in regulation of landomycin A biosynthesis in Streptomyces cyanogenus S136 and cross-complementation studies with Streptomyces antibiotic regulatory proteins encoding genes // Arch. Microbiol. - 2008. Vol.189, № 2 - P.111-120]. Основними продуцентами антрациклінових антибіотиків є актиноміцети, переважно бактерії роду Streptomyces. Ногаламіцин синтезується штамом S. nogalater. За допомогою хімічної деградації молекули ногаламіцину одержано низку сполук, які знайшли широке застосування у лікуванні ракових захворювань [Li H., Krueger C. The biochemical pharmacology of nogalamycin and its derivatives // Pharm. Ther. - 1991. - Vol. 51. - P. 239255.]. Сьогодні існує потреба в одержанні штамів S. nogalater з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину, використання яких дало б змогу значно здешевити біотехнологічне виробництво цього антибіотика. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб отримання штамів Streptomyces nogalater з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину шляхом надекспресії регуляторного гена - активатора його біосинтезу, клонованого у складі інтегративного і багатокопійного реплікативного векторів, що дасть змогу спростити одержання генетично-стабільних штамів надпродуцентів ногаламіцину. Поставлена задача вирішується так, що у способі отримання штамів Streptomyces nogalater з підвищеним рівнем біосинтезу ногаламіцину, який базується на уведенні додаткових копій регуляторного гена, як регуляторний ген використовують клонований у складі інтегративної кон'югативної плазміди pR3A та автономної кон'югативної плазміди pSOKA ген snorA, продуктом якого є активатор транскрипції структурних генів біосинтезу ногаламіцину. Для одержання штамів S. nogalater, з підвищеним рівнем синтезу ногаламіцину авторами вперше запропоновано використовувати ген snorA. Цей ген клоновано з хромосоми S. nogalater LV65 (ІМЕТ 43360) у складі плазміди pBluesnorA. Продуктом цього гена є білок - специфічний активатор транскрипції структурних генів біосинтезу 63824 4 ногаламіцину у S. nogalater. [Климишин Д., Грень Т., Федоренко В. Клонування та вивчення гена snorA, імовірного активатора транскрипції генів біосинтезу ногаламіцину у Streptomyces nogalater II Вісник Львів, ун-ту, сер. біол. - Вип. 50. - С. 3-10]. Використання гена snorA спрощує спосіб отримання штамів S. nogalater, з підвищеним рівнем біосинтезу ногаламіцину. Для клонування гена snorA авторами запропоновано використовувати інтегративний кон'югативний вектор pRT801. Інтегруючись у два сайти хромосоми S. nogalater, плазміда pRT801 не втрачається рекомбінантним штамом після пересівів за неселективних умов. Вектор pRT801 містить фрагмент оrіТ плазміди RK2 і тому може переноситись у клітини продуцента ногаламіцину шляхом міжродової кон'югації з кишковою паличкою Е. соlі. Це єдиний описаний на сьогодні ефективний спосіб перенесення рекомбінантних молекул ДНК у клітини штаму S. nogalater [Климишин Д.О., Громико О.М., Федоренко В.О. Використання міжродової кон'югації Escherichia coli - Streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам Streptomyces nogalater ІМЕТ 43360 // Цитол. и генет. - 2007. Т.41, №5. - С 263-267]. Перевагою цього способу одержання штамів S. nogalater з підвищеним рівнем біосинтезу ногаламіцину є те, що для селекції штамів, які несуть рекомбінантні плазміди, інтегровані у хромосому, не потрібно використовувати середовища з антибіотиками. Ефективність цього способу також визначається тим, що усі штами, що містять клонований в інтегративній плазміді ген snorA, характеризуються зростанням рівня синтезу ногаламіцину. Фіг. 1. Схема рекомбінантної плазміди pR3A, що містить ген snorA, клонований із хромосоми S. nogalater у складі фрагменту розміром 2,5 т.п.н., де: 1 - ген snorA R 2 - ген стійкості до апраміцину Apm 3 - ділянка ініціації кон'югаційного перенесення оrіТ 4 - attP-сайт актинофага ВТІ 5 - ген інтегрази актинофага ВТІ Фіг. 2. Схема рекомбінантної плазміди pSOKA, де: 1 - ген snorA 2 - реплікон плазміди рІJ101 R 3 - ген стійкості до тіостриптону Thr 4 - ділянка ініціації кон'югаційного перенесення оrіТ R 5 - ген стійкості до апраміцину Apm 6 - реплікон плазміди pBR322 Спосіб можна проілюструвати прикладами: За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), з використанням пари праймерів SnorAF 5'CGGAAGGCGTCGTGGTCGGT-3' та SnorAR 3'GGGTGGGCATTGACCGGTCG-5' ампліфікується фрагмент хромосоми S. nogalater розміром 2,5 т.п.н., що містить ген snorA. ПЛР проводять за наступних умов. Початкова денатурація (98 °С, 5 хв.), денатурація перед початком кожного нового циклу ПЛР (98 °С, 1 хв.), гібридизація праймерів (64 °С, 2 хв.), полімеризація (72 °С, 2 хв.). Ці цикли повторювати 35 разів. Добудову кінців продуктів 5 ПЛР проводити за температури 72 °С протягом 5 хв. Ампліфікований фрагмент лігується з вектором pBluescript, обробленим ендонуклеазою рестрикції EcoRV. Лігазною сумішшю трансформують клітини Е. соlі DH5a та відбирають колонії, що містять рекомбінантну плазміди на середовищі LA з ампіциліном (50 мкг/мл), 5-бром-4-хлор-3-індолілР-В-галактозидом (X-gal, 65 мкг/мл) та ізопропілтіогалактозидом (ІПТГ, 35 мкг/мл). З отриманих колоній Е. соlі виділяють плазмідну ДНК і доводять правильність отриманої в результаті цих маніпуляцій конструкції за допомогою рестрикційного аналізу [Федоренко В.О., Остапі Б.О., Гончар М.В., Ребець Ю.В. Великий практикум з генетики, генетичної інженерії та аналітичної біотехнології мікроорганізмів. - Львів: Видавн. центр ЛНУ імені Івана Франка, 2007. - 279 с]. Для експресії гена snorA у клітинах S. nogalater використовують реплікативний човниковий вектор pSOK101 та pRT801. Плазміда pSOK101 є висококопійною кон'югативною плазмідою. У клітинах актиноміцетів міститься від 250 до 500 копій на геном. Експресія клонованих у складі цього вектора генів відбувається із конститутивного промотора гена резистентності до еритроміцину ЕrmЕр із кластеру генів біосинтезу еритроміцину Saccharomyces erythrea. Плазміда pRT801 - інтегративна кон'югативна плазміда, що інтегрується у два сайти хромосоми S. nogalater [Климишин Д.О., Громико О.М., Федоренко В.О. Використання міжродової кон'югації Escherichia coli-Streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам Streptomyces nogalater ІМЕТ 43360 // Цитол. и генет. - 2007. - Т.41, №5. - С. 263-267]. Для створення таких конструкцій плазміду pBluescript з клонованим фрагментом хромосоми S. nogalater розміром 2,5 т.п.н., що містить ген snorA, обробляють ендонуклеазою рестрикції PvuII та елююють фрагмент розміром 2,9 т.п.н. Отриманий фрагмент змішують з лінеаризованими векторами pSOK101 і pRT801, попередньо обробленими ендонуклеазою рестрикції EcoRV та обробляють ДНК-лігазою. Лігазною сумішшю трансформують штам Е. соlі DH5a та відбирають апраміцинстійкі колонії білого кольору. У них виділяють плазмідну ДНК, яку аналізують за допомогою ендонуклеаз рестрикції EcoRI та Sad. У такий спосіб отримують плазміди pSOKA та pR3A. Плазмідами pSOKA та pR3A трансформують штам E.coli ET12567 (pUB307), який забезпечує перенесення рекомбінантних плазмід у клітини актиноміцетів [Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Gromyko О., Ostash В., Rebets Y., Bechthold A., Fedorenko V. IncP plasmids are most effective in mediating conjugation between Escherichia coli and Streptomycetes II Генетика - 2006. - T.42. N5. - C. 595-601]. Рекомбінантні плазміди переносять у штам S. nogalater способом міжродової кон'югації з Е. coli ET12567 (pUB307). Спорову суспензію S. nogalater висівають на мінімальне середовище Хопвуда [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptromyces genetics. Norwich, England: John Innes Foundation. 2000. 63824 6 634 p.] та вирощують 6-7 діб при 28 °С. Донорний штам Е. coli ET12567 (pUB307) вирощують до середини логарифмічної фази росту (OD600 - 0,65), осаджують центрифугуванням протягом 5 хв. при 8000 об/хв. Отриманий осад ресуспендують в 100 7 мкл фізіологічного розчину до концентрації 10 клітин/мл. Суспензію спор штаму реципієнта у 7 концентрації 10 спор/мл піддають тепловому шоку при 52 °С протягом 10 хв, після чого змішують із клітинами донора. Для ефективного проходження кон'югації у системі Е. coli - Streptomyces важливе значення має співвідношення донор - реципієнт. У випадку схрещувань Е. coli ET12567 - S. nogalater використовують клітини Е. coli та S. nogalater у співвідношенні 3:1. Кон'югаційну суміш розподіляють на поверхні чашок з вівсяним середовищем (вівсяне толокно - 64 г/л, агар - 16 г/л, вода - 1 л, рН до стерилізації - 7,2) та інкубують протягом 1820 год при температурі 28 °С. Схрещування переривають, додаючи 1 мл водного розчину антибіотиків, що містить апраміцин для селекції стрептоміцетів і налідиксову кислоту для пригнічення росту кишкової палички, у кінцевих концентраціях 50 і 200 мкг/мл, відповідно. Отримані апраміцин-резистентні клони S. nogalater перевіряють на наявність плазмід шляхом трансформації клітин Е. coli DH5a сумарною ДНК рекомбінантних штамів із подальшим рестрикційним картуванням виділених плазмід pSOKA та pR3A [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptromyces genetics. Norwich, England: John Innes Foundation. 2000. 634p.]. Рекомбінантні штами та вихідний штам S. nogalater висівають на ферментаційне середовище SG (глюкоза - 20 г/л, соєвий пептон - 10 г/л, СаСО3 - 2 г/л, СоСl2 - 0,001 г/л, рН до стерилізації 7,2) та вирощують 6 діб при 28 °С. По 1 мл культуральної рідини кожного зразка відбирають для визначення біомаси. Осаджують біомасу центрифугуванням 10 хв при 13000 тис. об/хв. та двічі відмивають дистильованою водою. Важать мікропробірку з біомасою та підсушують її вміст 3 доби при 37 °С. Суху біомасу визначають за різницею ваги мікропробірки з висушеною біомасою та самої мікропробірки. Спочатку порівнюють антибіотичну активность рекомбінантних штамів та штаму S. nogalater LV65 дикого типу за допомогою ногаламіцинчутливої тест-культури Sarcina lutea. На чашки з цією тесткультурою накладають паперові диски, на які наносять по 30 мкл. екстрактів антибіотиків. Проводять порівняння середніх значень індексів продуктивності (ІП) цих штамів, яке визначають як відношення зон пригнічення росту тест-культури до діаметра диска. Для штаму S. nogalater, що містить ген snorA у складі плазміди pSOKA, ІП становить у середньому 2,9 ± 0,2 мм, а для S. nogalater, що містить ген snorA у складі плазміди pR3A - 2,6 ± 0,2. Значення ІП для штаму S. nogalater дикого типу становить 2,3 ± 0,1. Для визначення концентрації ногаламіцину, антибіотики екстрагують із 20 мл культуральної рідини, змішуючи з рівним об'ємом хлороформу. Одержану суміш струшують протягом 2 год. 7 63824 Центрифугують протягом 10 хв. при 3 тис. об/хв і обережно відбирають нижню фракцію. Розчинник випаровують у роторному випарювачі, а екстракти розчиняють в 1 мл метанолу та аналізують на фотоелектрокалориметрі ( 480 нм). Кількість ногаламіцину визначають за калібрувальною кривою. Уведення додаткових копій гена snorA в складі pSOKA у клітини штаму S. nogalater приводить до зростання синтезу ногаламіцину у 4,6 разу. У ви 8 падку перенесення плазміни pR3A - рівень синтезу зростає у 2,5 разу. Таке зростання біосинтезу ногаламіцину характерне для 100 % отриманих транскон'югантів S. nogalater з рекомбінантними плазмідами. Аналіз продукції ногаламіцину рекомбінантними штамами, що містять копії гена snorA у складі pSOKA та pR3A та штамом S. nogalater дикого типу, представлено у таблиці. Таблиця Штам S. nogalater Lv65 Lv65 (pSOKA ) Lv65 (pR3A) Концентрація ногаламіцину, мкг/мл 2,0 ± 0,2 5,1 ± 0,2 9,2 ± 0,1 Одержані дані доводять зростання рівня синтезу ногаламіцину рекомбінантними штамами, що Комп’ютерна верстка А. Крулевський Біомаса, г/мл -3 3,5 x 10 -3 3,2 x 10 -3 3,4 x 10 ІП 2,3 2,7 2,6 підтверджує одержання передбачуваного технічного результату. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601