Спосіб отримання штамів streptomyces peucetius subspecius сaesius atcc 27952 з підвищеним синтезом доксорубіцину та здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин

Спосіб отримання штамів Streptomyces peucetius subspecius caesius ATCC 27952 з Винахід відноситься до генетики мікроорганізмів і може бути використаний для отримання промислово - цінних штамів стрептоміцетів з підвищеними біосинтезом важливого протипухлинного антибіотика доксорубіцину (DXR) та здатністю до перетворення культурою S peucetius subsp caesius екзогенне доданого даунорубіцину (DNR) (який є попередником доксорубіцину в шляху біосинтезу антрациклінів) в доксорубіцин Відомий спосіб отримання штамів Streptomyces peucetius-продуцентів даунорубіцину, який базується на опроміненні штаму ультрафіолетом та селекції отриманих мутантів за СТІЙКІСТЮ до церуленшу - шпбітора синтази жирних кислот та полікетидсинтази [Me Guire J С , Glofelty G , White R J Use of ceralemn in strain improvement of the daunorubicui fermentation // FEMS Microbiol Let - 1980 - V 9 - P 141 - 143] Проте, такий спосіб має цілий ряд недоліків Опромінення ультрафіолетом виявляє мутагенний ефект при низькій частоті виживання спор штамів актиноміцетів, що робить експеримент трудомістким і масштабним Серед мутантів стійких до церуленшу після індукції ультрафіолетовим опроміненням, виявляються як штами з підвищеним біосинтезом даунорубіцину, так і значна частка штамів, у яких синтез антрациклінів знижений, або відсутній Відомий спосіб отримання штамів S peucetius з підвищеним рівнем синтезу даунорубіцину, який базується на отриманні та регенерації протопластів продуцента [Красильникова О Л , Анисова Л Н , підвищеним синтезом доксорубіцину та здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин, який базується на обробці спор штаму І\І-метил-І\ГHiTpo-N-нітрозогуанідином з подальшим відбором мутантів на селективних середовищах з антибіотиком, який відрізняється тим, що, отримують мутанти СТІЙКІ до даунорубіцину, серед яких відбирають ті, у яких підвищена КІЛЬКІСТЬ та активність цитохром Р-450 вмісного ферменту (С-14 пдроксилази) Романова Н В и др Использование метода протопластирования для изменения качественного и количественного состава антрациклинового комплекса у S peucetius var caesius // Антибиот и химиотер -1988 -Т 33, № 7 - С 483-486] Проте значна частка клонів, що отримані з регенерованих протопластів, є генетично нестабільними і розщеплюються в наступних генераціях Це ускладнює отримання штамів, що стабільно зберігають ознаку, за якою проводилась селекція У отриманих таким способом клонів з підвищеним рівнем синтезу даунорубіцину та доксорубіцину зростає і синтез цілого ряду проміжних сполук, які не мають терапевтичної ЦІННОСТІ ВІДОМИЙ спосіб отримання рекомбінантних штамів S peucetius, який базується на трансформації протопластів вихідного штаму плазмідною ДНК, яка несе фрагмент з генами dnrA і В, які визначають СТІЙКІСТЬ до даунорубіцину [Stutzman Engwall К J Otten S L Hutchmson С R Regulation of secondary metabolism in Streptomyces specius and overproduction of daunorubicm in Streptomyces peucetius // J Bactenol - 1992 - 174, N1-P 144 154 ] Проте, такий метод передбачає складну процедуру попереднього тонування генів dnrA і В Отримані штами - продуценти, які несуть рекомбінантні плазміди в автономному стані, часто втрачають ці плазміди разом із тонованими генами, що обумовлюють підвищений синтез антибіотика, і тому необхідна розробка процедури підтримуючої селекції таких рекомбінантних штамів О о ю 50047 Відомий спосіб отримання рекомбінантних штамів актиноміцетів (який може бути застосований і до S peucetius), що здатні до перетворення sродоміценону до даунорубіцину і базується на трансформації мутантів, що нездатні синтезувати DNR, рекомбінантною плазмідою, яка несе кпонований ген dnrT в фрагменті геномної ДНК S peucetius [Патент US № 5652125 Scotti С, Hutchmson С R , Colombo A L , Fihpipmi S Process for preparing daunorubicm 1997] Проте, такий метод передбачає попереднє отримання і вивчення мутантів з певними пошкодженнями в біосинтезі даунорубіцину Автономні плазміди з тонованим геном dnrT можуть спонтанно втрачатися з високою частотою і необхідне додавання антибіотиків (СТІЙКІСТЬ ДО ЯКИХ визначається маркерним геном плазміди) до поживного середовища, в якому вирощується штам - продуцент для селекції штамів, що зберігають вказані рекомбінантні плазміди Відомий спосіб отримання рекомбінантних штамів актиноміцетів (який може бути застосований і до S peucetius), здатних до перетворення карміноміцину до даунорубіцину Цей метод базується на трансформації клітин актиноміцетів рекомбшантним плазмідою, що несе ген карміноміцин4-О-метилтрансферази [Патент US № 5364781 Hutcbbsor, С R, Maddun К М , Torti F, Colombo A L Process for preparing daunombicm 1994] Проте, такий метод предбачає складну процедуру попереднього тонування гену кармшоміцин-4-0метилтрансферази, а отримані штами - продуценти часто виявляються нестабільними До того ж вони характеризуються низьким рівнем перетворення карміноміцину в даунорубіцин (утворюється лише 5мкг/мл даунорубіцину з 10 міліграм/мл екзогенно доданого карміноміцину) Відомий спосіб отримання штамів актиноміцетів (який може бути застосований і до S peucetius), здатних до перетворення даунорубіцину у доксорубіцин Цей метод базується на трансформації клітин актиноміцетів рекомбінантною плазмідою, що несе ген doxA (кодує цитохром Р-450 - вмісний фермент) [Патент US № 592293 Strohl W R, Dickens M L , Desanti С R Methods of producing doxorabicm 1999] Проте, такий спосіб передбачає стадну процедуру попереднього тонування гену doxA, а отримані рекомбінантні штами - продуценти часто виявляються нестабільними До того ж такі штами перетворюють лише 50% екзогенно доданого даунорубіцину (утворюється 5мг/мл доксорубіцинуз 10мг/мл даунорубіцину) Відомий спосіб отримання рекомбінантних штамів S peucetius з підвищеним рівнем синтезу доксорубіцину, який базується на інактивації гену dnrU (ген, що кодує TDP-4 кето-6-дезокси-глюкозо3(5)епімеразу, який, очевидно, бере участь в біосинтезі бауміцинів, які утворюються з даунорубіцину) [Патент US № 5955319 Fonstein L , Otten S , Hutchmson С , Process for preparing doxorubicm 1999] Проте, такий спосіб передбачає складні процедури попереднього тонування фрагментів гену dnrU та його інсерційної інактивації в хромосомі штама - продуцента Найбільш близьким за технічною суттю - прототипом - є спосіб отримання штамів S peucetius NRRLB-5337 з підвищеним рівнем синтезу антра циклінових сполук [Segura D , Santana С , Gosh et al Antracyclmes isolation of overproducing strains by the selection and genetic recombination of putative regulatory mutants of Streptomyces peucetius var caesius //Appl Microbiol Biotechnol -1997 -48 P 615 - 621], основою якого є обробка г\І-метил-І\ГHiTpo-N-нітрозогуанідином та селекція тонів за СТІЙКІСТЮ до доксорубіцину Спосіб полягає у обробці суспензії спор штаму 5 peucetius subsp caesius NRRLB-5337 (5мл, що містить приблизно 1,6 106спор/мл) 2мМ N-метилN'-HiTpo-N-нітрозогуанідину протягом 35хв при 30°С Така обробка приводить до 99,9% загибелі клітин Суспензію спор актиноміцета після обробки мутагеном висівали на середовище з 0,25мМ доксорубіцину Стримані мутанти повторно перевіряли на СТІЙКІСТЬ до доксорубіцину Отримані доксорубіцин-резистентні мутанти тестували на синтез антрациклінів Для цього штами висівали в ферментаційне середовище та шкубували протягом 5 6 діб Міцелій збирали центрифугуванням (5000об/хв, Юхв) Антрацикліни екстрагували з міцелію сумішшю 0.05М сульфурної кислоти ацетон (1 4) і визначали вміст при X = 495нм АнтраЦИКЛІНОВІ сполуки також візуалізували за допомогою ТШХ Перед ТШХ аналізом екстракти концентрували шляхом підсушування, ресуспендували в СНзОН НгО (9 1), і наносили на пластинки TLC 60 та елюювали у системі розчинників метиленхлорид метанол вода (100 ЗО 2) Вміст антрациклінів також підраховували на CAMAG-TLC - Scaners II, використовуючи в ролі стандартів чисті штермедіати Для визначення білка зразки зібраного міцелію обробляли 0,ЗМ трихлороцтовою кислотою Центрифугували (2000д, Юхв) Ресуспедували у 0,4М NaOH і шкубували протягом 2 годин при 37°С Концентрацію білка визначали за стандартним методом Лоурі [Lowry О Н , Rosenbrough N J , Farr A L et al Determine total concentration of the protein method of Lowry // J Biol Chem - 1951 - V 193 - P 265 275] Як стандарт використовували альбумін сироватки крові теляти Автори не визначали рівень біосинтезу доксорубіцину отриманими мутантами та їх здатність до перетворення даунорубіцину у доксорубіцин В основу винаходу поставлено задачу удосконалення способу отримання штамів S peucetius subsp caesius- продуцентів доксорубіцину шляхом селекції мутантів, стійких до даунорубіцину, які характеризуються підвищеним вмістом та активністю цитохром-Р-450 вмісного ферменту (С-14пдроксилази), що забезпечить підвищений біосинтез доксорубіцину і ефективне перетворення екзогенно доданого даунорубіцину в доксорубіцин Запропонований спосіб базується на спостереженні про значну різницю в чутливості штаму S peucetius subsp caesius до власних антибіотиків даунорубіцину та доксорубіцину Доксорубіцин (14пдрокси даунорубіцин) менш токсичний для S peucetius subsp caesius, ніж його попередник в шляху біосинтезу антрациклінів даунорубіцин фіг1) У частини мутантів СТІЙКІСТЬ ДО даунорубіцину обумовлена високоефективним перетворенням метаболіта більш токсичного для штама (даунорубіцина) в менш токсичний (доксорубіцин) за 50047 рахунок підвищеного вмісту та ферментативної активності С-14-пдроксилази Поставлена задача вирішується так, як у відомому способі отримання штамів S peucetius NRRLB-5337 з підвищеним рівнем синтезу антрациклінових сполук, який базується на обробці спор штаму М-метил-М'-нітро-М-нітрозогуанідином та подальшим відбором мутантів резистентних до антибіотиків, але, на відміну від описаного методу, отримують мутанти, СТІЙКІ ДО даунорубіцину, серед них відбирають ті, у яких підвищені вміст і активність цитохром Р-450 - вмісного фермента (С-14 пдроксилази) Авторами вперше запропоновано використати отримання та відбір мутацій, які приводять до зростання КІЛЬКОСТІ та активності цитохром Р-450 вмісного фермента (С-14 - пдроксилази) для підвищення синтезу доксорубіцину штамами S peucetius subsp caesius При цьому виявлено, що зростання КІЛЬКОСТІ вказаного фермента корелює із зростанням СТІЙКОСТІ ДО даунорубіцину Тому відбір мутантів з підвищеним вмістом і активністю С14 - пдроксилази можна вести серед даунорубіцин - стійких мутантів S peucetius subsp caesius Виявлено також, що зростання вмісту даного ферменту надає штаму здатність перетворювати до 93,4% екзогенно доданого (30мкг/мл) даунорубіцину у доксорубіцин за 24 години культивування даунорубіцин-стійких штамів Така властивість є цінною, оскільки дає простий спосіб отримання більш цінного та більш дорогого антибіотика - доксорубіцину з його попередника даунорубіцину, який має значно нижчу вартість Фіг 1 Залежність виживання спор штаму S peucetius subsp caesius ATCC27952 від концентрації даунорубіцину або доксорубіцину в середовищі По осі абсцис десятковий логорифм процента виживання спор даного штаму По осі ординат концентрація антибіотика в МС, мкг/мл, 1 - виживання спор на середовищі з даунорубіцином, 2 виживання спор на середовищі з доксорубіцином Фіг 2 - 4 Хроматографічне розділення антрациклінових сполук, екстрагованих з культур вихідного штаму 27952(А) та його даунорубіцин - (Б) і доксорубіцин (В) - резистентних мутантів без додавання даунорубіцинута після його додавання до 48 годинних культур цих штамів 1-маркер даунорубіцин (DNR) та доксорубіцин (DXR), А) 2) 27952 з додаванням DXR, 3) 27952 з додаванням DNR, Б) мутанти 2) dnrlOO, 3) dnrlOO з додаванням DNR, 4) dnr2024, 5) dnr2024 з додаванням DNR, 6) dnr2043, 7) dnr2043 з додаванням DNR, В) мутанти 2) dxr2025, 3) dxr109, 4) dxr1010, 5) dxr303, 6) dxr503, 7) dxr5015, 8) dxr504, 9) dxrlO8 (всі з додаванням даунорубіцину) Спосіб можна проілюструвати прикладами Суспензію спор S peucetius subsp caesius АТСС 27952 (близько 108 спор/мл) з культури, вирощеної протягом 5 діб на середовищі Чапека [Гаузе Г Ф , Преображенская Т П , Свешникова М А и др Определитель актиномицетов М Наука, 1983, 245с], осаджують центрифугуванням (12000об/хв, Юхв) і ресуспендують в 1мл тріс-малешового буферу [Hopwood D А , Bibb М J , Chater К F et al Genetic Manipulation of Streptomyces a laboratory manual Norwich The John Innes Foundation 1985 356p ] (pH8), що містить 2мг/мл N-метил-М'-нітроN-нітрозогуанідином Спори шкубують 45хв при 37°С Частота виживання спор становить при цьому 0,1 ± 0,05% Оброблену суспензію спор осаджують центрифугуванням (12000об/хв, Юхв) та тричі промивають в стерильній дистильованій воді для припинення дії мутагену Спори у розведеннях 10° та 10 1 висівають на чашки, які містять 20мкг/мл даунорубіцину в мінімальному середовищі Хопвуда (МС) [Hopwood D А , Bibb М J, Chater К F et al Genetic Manipulation of Streptomyces a laboratory manual Norwich The John Innes Foundation 1985 356p] В контрольному варіанті експерименту висівають десятикратні розведення спор на МС без антибіотика Інкубують культуру 7 діб при 28°С Отримані мутанти повторно перевіряють на СТІЙКІСТЬ до даунорубіцину Стабільні мутанти висівають на середовище Чапека, інкубують 7 діб при 28°С Отримують суспензію спор кожного з мутантів і висівають газоном (приблизно 106 спор/чашку) на чашки з кукурудзяним середовищем (КС) [Гаузе Г Ф , Преображенская Т П , Свешникова М А и др Определитель актиномицетов М Наука, 1983, 245с] Культури мутантів інкубують 7 діб при 28°С Вирізають агарові диски діаметром 1,5см, гомогенізують їх і заливають 2мл суміші хлороформ метиловий спирт (9 1) Інкубують 12 годин, відбирають органічну фазу і висушують під вакуумом Осад розчиняють в 50мкл метилового спирту і наносять на силікагелеві пластинки Проводять тонкошарову хроматографію для визначення якісного складу антрациклінових сполук Як рухливу фазу для тонкошарової хроматографії використовують систему розчинників СНСІз СНзСООН С2Н5ОН Н2О (80 20 16 6) Як стандарт використовують чисті даунорубіцин та доксорубіцин, як контроль екстракти вихідного штаму Використовуючи дані проведеного ТШХаналізу, відбирають ті варіанти, які синтезують лише доксорубіцин в кількостях вищих, ніж у вихідного штаму Відібрані варіанти висівають в середовище TSB [Hopwood D А , Bibb М J , Chater K F et al Genetic Manipulation of Streptomyces a laboratory manual Norwich The John Innes Foundation 1985 356p ] Інкубують 2 доби при 28°C Осаджують біомасу (5000об/хв, Юхв) і ресуспендують в 0,1 М фосфатному буфері [0,2М Na2HPO4 - 94,7мл 0,2М NaH2PO4 - 5,7мл] Біомасу гомогенізують в скляному гомогенізаторі Уорінга Уламки клітин осаджують протягом 45хв при -4°С По 500мл із гомогенізату кожного штаму відбирають для визначення концентрації білку за методом Лоурі [Lowry О Н , Rosenbrough N J , Fair A L et al Determine total concentration of the protein method of Lowry // J Biol Chem - 1951 - v 193 - P 265 275 ] Супернатант відбирають та визначають вміст цитохрому Р-450 • Відбирають ті варіанти у яких його КІЛЬКІСТЬ є найвищою Отримані варіанти висівають в середовище TSB, Інкубують 48год при 28°С, додають 30мкг/мл даунорубіцину і інкубують ще 48 годин Антрацикліни екстрагують рівним об'ємом суміші СНСІз C2HsOH (9 1) Проводять ТШХ - аналіз, як описано раніше Визначають вміст утвореного доксорубіцину (в %) скануючи пластинки, або використовуючи метод описаний раніше [Segura D , Santana C, Gosh et al 50047 Antracyclmes isolation of overproducing strains by the selection and genetic recombination of putative regulatory mutants of Streptomyces peucetius var caesius //Appl Microbiol Biotechnol -1997 -48 P 615 - 621] Відбирають ті варіанти, які дають найвищий процент перетворення даунорубіцину в доксорубіцин Підбір антибіотика та його концентрації для селекції штаму S peucetius subsp caesius ATCC 27952, проводили експериментально Дані зведені в таблиці 1 і 2 та фіг 1 і 2 - 4 Даунорубіцин (попередник доксорубіцину) є значно токсичнішим для штаму S peucetius subsp caesius ATCC 27952 порівняно з доксорубіцином (фиг 1) Така властивість дозволяє використовува 8 ти для селекції значно нижчі концентрації даного антибіотика у порівнянні з більш дорогим антибіотиком - доксорубіцином Серед даунорубіцин-резистентних мутантів, які володіють антибіотичною активністю, КІЛЬКІСТЬ таких, які синтезують доксорубіцин є максимальною, а серед індукованих М-метил-N'-HiTpo-Nнітрозотуанідином даунорубіцин-резистентних мутантів становить 100% (табл 1) Лише серед даунорубіцин-резистентних мутантів виявлено такі, які синтезували в основному доксорубіцин (табл 2) КІЛЬКІСТЬ та активність цитохром-Р-450 вмісного фермента у таких мутантів були також найвищими (фіг 2 - 4, табл 2) Таблиця 1 Дані порівняльного аналізу якісного складу синтезованих антрациклінових сполук окремими клонами вихідного штаму та його даунорубіцин-та доксорубіцин-резистентних мутантів Число штамів, у яких виявлено дану сполуку Ідентифіковані антрациклінові сполуки DXR" DNR4' DXRіDNR DXRi 13-DHDD) Неідентифіковані сполуки0' DXR DNR Спонтанні Клони 27952-2 DNR r " DXR r " Виявлено лише 0 5 0 0 0 0 0 4 8 0 3 0 7 2 1 Виявлено неідентифіковані сполуки та 7 5 1 6 0 8 3 2 7 0 10 0 0 0 0 0 2 3 0 0 0 23 33 28 Індуковані N-MeTHn-N'-HiTpo-Nнітрозогуанідином Клони 27952-2 DNR r DXR r 0 0 0 0 9 6 0 0 0 0 0 0 2 0 3 1 0 0 15 0 0 DXRіDNR 7 8 9 DXRi 13-DHD 0 0 0 DNR і 13-DHD 1 0 0 DXR, DNR, 13-DHD 1 0 1 13-DHD 2 0 0 КІЛЬКІСТЬ перевірених штамів 39 14 15 Примітки 1) даунорубіцин - резистентні мутанти, 2) доксорубіцин - резистентні мутанти, 3) доксорубіцин, 4) даунорубіцин, 5) 13 - дипдродаунорубіцин, 6) антрациклінові сполуки, які розділяються в системі СНСІз СНзСООН С 2 Н 5 ОН Н 2 О ( 8 0 20 16 6) Таблиця 2 КІЛЬКІСНИЙ ВМІСТ антрациклінів, даунорубіцину та доксорубіцину а також ефективність перетворення даунорубіцину в доксорубіцин та вміст цитохрома Р-450 Штам 27952-2 DnrlOO Dnr101 Dnr20/42 Dnr20/43 Dxr10/10 Dxr20/25 Антрацикліни 11,3 ± 3,4 15,7 ± 6 , 3 12,9 ± 4 , 6 21,8 ± 7 , 8 102,9 ± 1 0 , 4 62,4 ± 4 , 9 13,6 ± 4 , 6 Вміст, МКГ/МЛ білка Даунорубіцин Доксорубіцин 1,5 ± 1,2 2,4 ± 1,1 0 10,0 ± 2 , 3 0 8,1 ± 2 , 6 5,42 ± 1 , 9 5 12,6 ± 2 , 9 8 14,20 ± 3 , 0 7 45,1 ± 4 , 9 15,68 ± 6 , 2 26,1 ± 7 , 4 15,64 ± 1 , 3 3,8 ± 0 , 9 Використання запропонованого підходу до вирішення задачі, а саме отримання та використання мутацій, підвищення КІЛЬКОСТІ та фермен Перетворення за 24год DNR у DXR, % 0 93,4 ± 4 , 2 86,5 ± 2 , 3 57,7 ± 3 , 4 82,0 ± 1 , 1 36,5 ± 2 , 7 0 Вміст цитохрома Р-450, нмоль/мг білка 6,1 ± 1 , 3 219,8 ± 8 , 7 122,1 ± 6 , 3 33,0 ± 3 , 4 109,8 + 4,3 21,9 ± 4 , 1 7,85 + 1,7 тативної активності DoxA дало змогу отримати передбачуваний технічний результат, який підтверджено даними табл 2 50047 2 10 5 10 20 33 V DNR і і « DXR DNR I У S 7 Фіг.2 DNR I DXR і Ф 2 г 4 5 Фіг.4 б і 6 5 4 Фіг.З 3 2 11 50047 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 12