Спосіб отримання штамів streptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів

Спосіб отримання штамів Streptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу лан Винахід відноситься до генетики, селекції та генетичної інженери мікроорганізмів і може бути використаний для отримання штамів Streptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу протипухлинних антибіотиків ландоміцинів та їхніх похідних, отриманих в результаті генно-інженерних маніпуляцій з генами біосинтезу, а також для оптимізацм експресії генів біосинтезу ландоміцину Е в гетеролопчних штамах продуцентах полікетидних антибіотиків Ландоміцини належать до групи полікетидних ангуциклінових антибіотиків зі значною протипухлинною активністю Вони перевищують за своєю здатністю пригнічувати ріст ракових клітин такі ВІДОМІ хіміотерапевтичні препарати як цисплатин, МІТОМІЦИН С, блеоміцин, метотрексат, є активними проти ряду карцином, даунорубіцин-стійких ЛІНІЙ ракових клітин та клітин аденоми простати, що є унікальною властивістю серед полікетидних антибіотиків Проте висока загальна цитотоксичність цих антибіотиків зумовлює необхідність створення нових ландоміцинів методами генетичної інженери Відомий спосіб отримання рекомбінантних штамів стрептоміцетів, що здатні до підвищеного синтезу антибіотиків, який базується на спрямованому руйнуванні генів absAI та absA2, що кодують білки двокомпонентної регуляторної системи „регулятор-протешкіназа" Ця система функціонує в ДОМІЦИНІВ, який базується на введенні додаткових копій регуляторного гена, продукт якого активує експресію структурних генів біосинтезу антибіотиків, тонованого в складі автономних плазмід, який відрізняється тим, що як регуляторний ген використовують тонований в складі інтегративної кон'югативної плазміди pSI2-9 та автономної кон'югативної плазміди pSOI1112, ген Indl, що кодує активатор транскрипції структурних генів біосинтезу ландоміцинів клітинах ряду штамів стрептоміцетів (S coehcolor, S avermitihs та ІНШІ) І регулює експресію структурних генів біосинтезу полікетидних антибіотиків Заміщення генів absAI та absA2 на ген СТІЙКОСТІ ДО еритроміцину веде до значного зростання біосинтезу антибіотиків [Патент US №796414 Champness, Wendy С , Brian, Paul, Anderson, Todd В Method, DNA and bacteria for hyperproduction of an antibiotic due to disruption of an AbsA gene] Однак, даний ПІДХІД передбачає складну процедуру попереднього виявлення, клонування, встановлення нуклеотидної ПОСЛІДОВНОСТІ та спрямованого руй нування подібних генів у штамі S globisporus Відомий спосіб отримання штамів стрептоміцетів з підвищеним рівнем біосинтезу антибіотиків, який базується на спрямованому заміщенні генів специфічних репресорів біосинтезу на генні касети, що забезпечують СТІЙКІСТЬ ДО певного антибіотика [Патент US № 390721 Stutzman-Engwall, Kim J , Price, Brenda S Streptomyces avermitihs regulatory genes for increased avermectm production] Проте в кластері генів біосинтезу ландоміцину Е S globisporus не виявлено подібних генів негативного контролю, тому такий спосіб не може бути використаний для даного штаму Відомий спосіб індукції біосинтезу полікетидних антибіотиків у штамів стрептоміцетів, який базується на отриманні мутантів, стійких до стрептоміцину, хлорамфеніколу, рифампіцину Мутації О о (О 62200 СТІЙКОСТІ до цих антибіотиків, що зумовлені змінами рибосомальних білків, є плейотропними та можуть вести до активації біосинтезу антибіотиків у стрептоміцетів [Оспі К Actinorhodin synthesis mdution by mutations rpsL encoding nbosomal protein S12, that confers resistance to streptomycin in Streptomyces hvidans and Streptomyces coehcolor A(3)2 // J Bacteriology - 1996 - vol193 - №4P 7652-7667 , Громиш О , Басілія Л , Кириченко Н , Федоренко В Отримання і характеристика стрептоміцин-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е Streptomyces globisporus 3-1 // Вісник Львів, ун-ту, сер бюл - 2000 - Вип 26 - С 46-53] Проте даний спосіб передбачає складну процедуру пошуку спонтанних та індукованих мутантів стрептоміцетів, стійких до антибіотиків, виявлення класів мутантів з підвищеним синтезом, що вимагає часу та значних зусиль Мутації резистентності виявляють значний плейотропний ефект на морфогенез та метаболізм бактерій Крім того, такі мутанти є нестабільними і вимагають вирощування у присутності антибіотиків Даний спосіб не може бути застосований для рекомбінантних штамів, створених на основі S globisporus 1912, в зв'язку з високою ймовірністю втрати рекомбінантних ДНК в результаті мутагенних обробок Найбільш близьким за технічною суттю прототипом є спосіб отримання штамів S peucetius з підвищеним рівнем біосинтезу протипухлинного антибіотика даунорубіцину та його попередника є-родоміцинону [Stutzman-Engwall К J , Otten S L , Hutchmson С R Regulation of secondary metabolism in Streptomyces species and overproduction of daunorubicm in Streptomyces peucetius // J of Bacteriology - 1992 - vol 174, N 1 - P144-154] Спосіб базується на використанні регуляторного гену dnrl, продукт якого активує експресію структурних генів біосинтезу даунорубіцину Ген dnrl, клонований у складі автономних низькокопійної pWHM374 та висококопійної pWHM357 плазмід, вводили в штам дикого типу S peucetius АТСС29050 шляхом трансформації протопластів Відбір трансформантів проводили на регенераційному середовищі R2YE за СТІЙКІСТЮ ДО тюстрептону, яка визначається маркерним геном векторів -У випадку штамів, що несли ген dnrl в плазміді pWHM374, спостерігалось зростання рівня біосинтезу даунорубіцину в 9 разів, a s -родоміцинону - у 20 разів У випадку штамів, що несли плазміду pWHM357, рівень продукції даунорубіцину зростав в 20 разів, a s -родоміцинону - у 80 разів Проте даний спосіб не може бути використаний для отримання штамів S globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів, оскільки регуляторний білок, що кодується геном dnrl, є високоспецифічним та не здатний впізнавати регуляторні ПОСЛІДОВНОСТІ в промоторних ділянках структурних генів біосинтезу ландоміцинів та активувати їхню експресію [Ребер Ю , Осташ Б Гетерологическая экспрессия генов биосинтеза ландомицина Е в модельных штаммах стрептомицетов // 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых - (20-24 мая, - 2002 г - Пущино) - 4 1 , с 308] Крім того при використанні автономних плазмід спостерігається висока частота їхньої втрати підчас культивування рекомбінантних бактерій у неселективних умовах Такі штами потребують постійної підтримуючої селекції на середовищі з тюстрептоном та періодичної перевірки присутності ВІДПОВІДНИХ плазмід Низька ефективність трансформації протопластів S globisporus не дозволяє використовувати даний метод введення рекомбінантних плазмід [А Лужецький, А Мазепа, О Мар'їна Міжродова кон'югація Eschenchia coll Streptomyces - використання для введення генетичної інформації в штами Streptomyces kanamyceticus і Streptomyces globisporus // Вісник Львів, ун-ту, сер бюл - 2000 - Вип 25 - С 74-80] Крім того маркерний ген СТІЙКОСТІ ДО тюстрептону, використаний авторами, може негативно впливати на вторинний метаболізм та морфогенез рекомбінантних штамів [Mark L Chiu, Marc Folcher, Takaaki Katoh, Anna Maria Pugha et al Broad Spectrum Thiopeptide Recognition Specificity of the Streptomyces hvidans TipAL Protein and Its Role in Regulating Gene Expression //J Biol Chem - 1999 V 274(29) - P 20578-20586] В основу винаходу поставлено задачу удосконалити спосіб отримання штамів S globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів шляхом оптимізаци експресії структурних генів біосинтезу ландоміцинів, що дозволить збільшити рівень продукції цих антибіотиків Поставлена задача вирішується так, як у відомому способі отримання штамів S peucetius з підвищеним рівнем біосинтезу даунорубіцину та s родоміцинону [Stutzman-Engwall К J , Otten S L , Hutchmson С R regulation of secondary metabolism in Streptomyces specius and overproduction of daunorubicm in Streptomyces peucetius // J Bacteriology - 1992 - vol 174, № 1 - P 144-154], який базується на введенні додаткових копій регуляторного гену, продукт якого активує експресію структурних генів біосинтезу антибіотиків, тонованого в складі автономних плазмід, а як регуляторний ген використовують тонований в с т а д і інтегративної кон'югативної плазміди pSI2-9 та автономної кон'югативної плазміди pSOII 112, ген Indl, що кодує активатор транскрипції структурних генів біосинтезу ландоміцинів Для підвищення рівня біосинтезу ландоміцинів штамом S globisporus авторами вперше запропоновано використати тонований в с т а д і ВІДПОВІДНИХ рекомбінантних плазмід ген Indl Цей ген отримано з бібліотеки генів S globisporus 1912 та встановлено його нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ [К Pankevych, H Kruegel, V Fedorenko Cloning and sequencing of a putative positive transcription regulator gene of landomycm E biosynthetic gene cluster of Streptomyces globisporus 1912 // Visnyk ofL'viv University, Biol Series - 2001 - V27 - P 97-105], у результаті аналізу якої виявлено, що ген Indl, розміром 786 п н , кодує білок, що складається з 261 амінокислотного залишку і має високий ступінь гомології до відомих транскрипційних факторів стрептоміцетів, що контролюють біосинтез полікетидних антибіотиків Його заміщення на ген СТІЙКОСТІ до канаміцину веде до повного припинення біосинтезу ландоміцину Е штамом S globisporus 1912 [Y Rebets, В Ostash, A Luzhetskyy, A 62200 Bechthold, V Fedorenko Pathway-specific regulatory genes for landomycm E and A biosynthesis of Streptomyces globisporus 1912 and S cyanogenus S136, a new member of SARP family// VAAM workshop "Biologie bactenellerNaturstoffproduzenten" Proc (Freiburg, Germany, 29 September - 1 October 2002) - Theses P 28 ], а надекспресія - до підвищення рівня продукції антибіотиків Використання гену Indl спрощує спосіб отримання штамів S globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу лаНДОМІЦИНІВ Враховуючи складність культивування в промислових умовах рекомбінантних штамів бактерій, що несуть автономні плазміди, для т о н у в а н н я гену Indl запропоновано використати інтегративний човниковий вектор pSET152, який стабільно успадковується у неселективних умовах за рахунок інтеграції в геном стрептоміцетів Даний вектор містить опТ плазміди RK2, що дозволяє використовувати кон'югацію для перенесення створених на його основі плазмід у штами стрептоміцетів Це забезпечує вищу частоту отримання рекомбінантних штамів S globisporus, ніж трансформація протопластів [Flett F , Mersmias V , Smith С Р High efficiency mtergenenc conjugal transfer of plasmid DNA from Eschenchia coh to methyl -DNArestncting Streptomycetes // FEMS Microbiol Lett 1 9 9 7 - v 1 5 5 - P 223-229] Запропонований спосіб може бути використаний для підвищення рівня біосинтезу нових полікетидів, отриманих в результаті генно-інженерних маніпуляцій зі штамом S globisporus, оскільки підчас мутагенних обробок часто втрачаються плазміди, т о н о в а н і в штамі, та виникають ІНШІ мутації, що впливають на біосинтез антибіотиків та життєздатність бактерій Цей спосіб є значно простішим за ІНШІ ВІДОМІ методи отримання продуцентів з підвищеним рівнем біосинтезу полікетидних антибіотиків та набагато ефективнішим, оскільки всі отримані штами характеризуються зростанням продукції ландоміцинів Фіг 1 Схема рекомбінантних плазмід р8І2-9 та pSOII 112, що містять ген Indl, т о н о в а н и й у складі фрагменту ДНК, розміром 3 т п н Сайти впізнавання ендонуклеаз рестрикції В - BamHI, EI EcoRI Фіг 2 Результати ВЕРХ аналізу екстрактів штамів S globisporus 1912 (A), S globispdrus 1912 (pSI2-9) (В), S globisporus 1912 (pSOII 112) (С) Пік поглинання з часом виходу (RT) в області 15,215,6 відповідає ландоміцину Е (LE) Спосіб можна проілюструвати прикладами Клон A.GEM1 8 з бібліотеки генів S globisporus обробляють ендонуклеазою рестрикції Sad та отримані фрагменти розділяють електрофоретично Проводять елюцію фрагменту ДНК розміром 8 т п н , що містить ген Indl Вектор, для Е coh pUC19 лінеаризують ендонуклеазою рестрикції Sad та лігують з елюйованим фрагментом ДНК Лігазною сумішшю трансформують Е coh DH5a та відбирають т о н и , що несуть рекомбінантні плазміди на середовищі LA з ампіциліном (50 мкг/мл), 5-бром-4-хлор-3-шдоліл- р -Dгалактозидом (X-gal, 65 мкг/мл) та ізопропілтюгалактозидом (ІПТГ, ЗО мкг/мл), з яких плазмідну ДНК аналізують рестрикціиним картуванням ендонуклеазою рестрикції Sad [Гловер Д Клонирование ДНК Методы М , Мир - 1989 т 1 - 374с ] У результаті отримано плазміду pUR7, що містить вставку ДНК розміром 8 т п н з геном Indl Для експресії в S globisporus ген Indl субклонують в складі фрагменту ДНК розміром З т п н з плазміди pUR7 в човникові кон'югативні вектори pSET152TapSOK101 Плазміду pUR7 обробляють ендонуклеазою рестрикції EcoRI та проводять елюцію фрагменту ДНК розміром 3 т п н , що мітить ген Indl Векторну ДНК лінеаризують ендонуклеазою рестрикції EcoRI та лігують з елюйованим фрагментом Лігазною сумішшю трансформують Е coh DH5a та відбирають клони, що несуть рекомбінантні плазміди на середовищі LA з апраміцином (50 мкг/мл), X-gal (65 мкг/мл) та IPTG (ЗО мкг/мл) Виділену з них плазмідну ДНК аналізують рестрикціиним картуванням ендонуклеазами рестрикції EcoRI та BamHI [Гловер Д Клонирование ДНК Методы М , Мир - 1989 - т і - 3 7 4 с ] У такий спосіб отримано плазміди pSI2-9 та pSOU 112, що в фрагменті ДНК розміром З т п н містять ген Indl та 300 п н 5'району з його промоторною ПОСЛІДОВНІСТЮ Плазмідами pSI2-9 та pSOU 112 трансформують штам Е coh ET12567 (pUB307), який за рахунок tra-генів плазміди pUB307 забезпечує кон'югативне перенесення корезидентних плазмід [Flett F, Mersmias V , Smith С Р High efficiency mtergenenc conjugal transfer of plasmid DNA from Eschenchia coh to methyl -DNA-restnctmg Streptomycetes // FEMS Microbiol Lett - 1997 - v 155 - p 223229] Одну колонію нічної культури Eschenchia coh засівають в 5 мл середовища LB з канаміцином (50 мкг/мл) Культуру вирощують до оптичної густини OD6oo-0,1, переносять в мікропробірки на 1,5 мл та осаджують центрифугуванням 1хв при 10 тис об/хв Зливають супернатант та клітини ресуспендують в 50 мкл середовища LB Отриману суспензію клітин охолоджують в льоді 5хв , додають 1 мл 0 1 М розчину СаСЬ та шкубують в льоді 1 год Клітини осаджують центрифугуванням при 10 тис об/хв протягом 1 хв, зливають супернатант та ресуспендують в ЮОмкл 0 1М розчину СаСЬ Інкубують 1 год в льоді та додають розчин плазмідної ДНК Інкубують 1 год в льоді, після чого клітини піддають тепловому шоку протягом 1 хв при 40°С, охолоджують та додають 1 мл середовища LB Інкубують 1 год при 37°С для індукції експресії генів СТІЙКОСТІ та висівають на чашки з середовищем LA з апраміцином (50 мкг/мл) та канаміцином (50 мкг/мл) Чашки інкубують при 37°С 16 год, після чого трансформанти пересівають на свіже середовище І_А з апраміцином (50 мкг/мл) та канаміцином (50 мкг/мл) Рекомбінантні плазміди в S globisporus 1912 переносили шляхом міжродової кон'югації з ВІДПОВІДНИМИ штамами Е сом ЕТ12567 (pUB307) Суспензію спор S globisporus висівають на кукурудзяне середовище [Гаузе Г Ф , Преображенская Т П , Свешникова M A и др Определитель актиномицетов М , Наука, 1983, 2 4 5 с ] та вирощують 6 діб при 28°С для отримання спорової суспензії 8 62200 Штами Е coli ET12567 (pUB307) з плазмідами pSI2-9 та pSOI1112 висівають на чашку з середовищем LA з апраміцином (50 мкг/мл) та канаміцином (50 мкг/мл) та вирощують 18 год при 36°С Готують суспензію клітин в 4 мл середовища LB Одночасно готують суспензію спор штаму S globisporus в 8 мл середовища LB Спори піддають тепловому шоку, шкубуючи Юхв при 50°С Суспензію клітин та суспензію спор стрептоміцетів осаджують центрифугуванням 5 хв при 5 тис об/хв , зливають супернатант, розчиняють в 100 мкл середовища LB, змішують між собою та висівають на чашки з вівсяним середовищем (вівсяне толокно - 64 г/л, агар - 16 г/л, вода - до 1 л, рН до стерилізації - 7,2) Чашки Інкубують 1220 год при 28°С та заливають 1 мл розчину апраміцину (2 мг/мл) та налідиксової кислоти (2 мг/мл) Чашки Інкубують 5-6 діб при 28°С та відбирають екскон'юганти, висіваючи на кукурудзяне середовище з апраміцином (50 мкг/мл) та налідиксовою кислотою (100 мкг/мл) Отримані штами перевіряють на наявність плазмід Вирощують в 50 мл рідкого середовища YEME та виділяють сумарну ДНК, - зразками якої трансформують штам Е coli DH5a [Hopwood DA , Bibb M J , Chater К F , Kieser T , Bruton С J , Kieser H M , Lydiate D J , Smith С P , Ward J M , ShrempfH Genetic manipulation 'of Streptomyces A laboratory manual The John Innes Foundation Norwich-1985356 p ] Плазмідну ДНК з трансформантів аналізують рестрикційним картуванням Отримані рекомбнантні штами та вихідний штам S globispoms висівають у ферментаційне середовище SGP (глюкоза - 20г/л, соєвий пептон 10 г/л, СаСОз - 2 г/л, СоСІ2 - 0,001 г/л, рН до стерилізації - 7,2) та вирощують при 28°С 5 діб По одному мл культуральної рідини кожного штаму відбирають для визначення концентрації білка Осаджують біомасу центрифугуванням Юхв при З тис об/хв та ДВІЧІ відмивають дистильованою водою, додають 1 мл трихлороцитової кислоти та інкубують 40 хв при 20-25°С Центрифугують при 13тис об/хв протягом 1 хв , супернатант зливають та розчиняють осад в 500 мкл 0,4Н розчину NaOH Інкубують 12 годин при кімнатній температурі та відбирають по 100 мкл кожного зразку Концентрацію білка визначають за методом Лоурі [Lowry О Н , Rosenbrough N J , Farr A L , et al Determine total concentration of the protein method of Lowry//J Biol Chem -1951 -V 193 - P 265-275] Антибіотики екстрагують з однакового об'єму культуральної рідини кожного штаму, додаючи рівний об'єм етилацетату та інтенсивно струшуючи суміш на протязі 1 год Відбирають фазу етилацетату та випаровують розчинник в роторному випаровувачі Екстракти розчиняють в 100 мкл етанолу та аналізують методом ВЕРХ на колонках С 18 у градієнті метанол-вода (0-100) КІЛЬКІСТЬ ландоміцину Е визначають за висотою ПІКІВ на хроматограмах, що відповідають фракції виходу 15,215,5 хв У випадку використання штаму дикого типу S globispoms 1912 введення додаткових копій гену Indl у складі рекомбінантної плазмід и pSOH 112 веде до збільшення продукції ландоміцину Е в 10-12 разів, при чому частка цього антибіотика в сумарному екстракті порівняно з чатками інших сполук зростає в 14 разів У випадку штамів, що несуть плазміду pSI2-9, біосинтез ландоміцину Е збільшується в 9-11 разів, а його частка в не очищеному екстракті - в 10 разів Таке зростання біосинтезу антибіотиків спостерігалось у 100% отриманих клонів екскон'югантів S globisporus 1912 Дані порівняльного аналізу продукції ландоміцину Е штамом S globisporus 1912 та його похідних, що несуть додаткові копи гену Indl в складі ВІДПОВІДНИХ рекомбінантних плазмід, представлено в таблиці Таблиця Штам С, концентрація білка, мг/мл 1912 1912 (pSI2-9) 1912 (pSOI1112) 0,53 0,42 0,36 Частка ландоміцину Е AU, висота пікуланв не очищеному екстдоміцину Е при ВЕРХ ракті, % 11754 1,05 131361 10,13 143387 14,62 Рівень біосинтезу І_Е,% 100 1117 1220 Використання запропонованого способу отримання штамів S globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів дозволяє отримати передбачуваний технічний результат 62200 10 Indl pT 9 S2 85тпн 03 C1 attP опТШС2 pUC aae(3)IV Indl aac(i)lV rh;of onTRK2 ФІГ.2 ФІГІ Комп'ютерна верстка Л Ціхановська Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119