Пристрій для кріоконсервації біологічних об’єктів тваринного та рослинного походження

Пристрій для кріоконсервації біологічних об'єктів тваринного та рослинного походження, що складається з посудини Дьюара та термоблока, установленого у її горловині з можливістю зміни глибини зану рення відносно верхнього краю горловини посудини Дьюара, причому термоблок містить диск, що утримує ємність для розміщення контейнерів з біооб'єктами, термодатчик та металевий циліндричний корпус, виконаний з можливістю вертикального переміщення та фіксації відносно ємності, який відрізняється тим, що ємність для розміщення контейнерів з біооб'єктами виконана у вигляді суцільного циліндричного металевого стакана, жорстко з'єднаного з диском за допомогою металевих стрижнів, а терморезистор закріплений на внутрішньому боці металевого стакана. Корисна модель відноситься до кріобіології, а саме до пристроїв для кріоконсервації біологічних об'єктів тваринного та рослинного походження і може бути застосована у біотехнології тваринництва та рослинництва. Відомий пристрій для заморожування ембріонів великої рогатої худоби (ВРХ) [Пат. №1802700 СССР, МПК 5 A61D 19/00. Установка для замораживания зародышей/ Осташко Ф.И., Безуглый Н.Д., Валигура Е.Г., Горбунов Л.В./ заявка №4922296/14 Заявл. 29.03.91. Опубл. 15.03.93. Бюл. №10, 1993], що складається з посудини Дьюара, в горловині якої жорстко закріплений фіксаторами термоблок, що являє собою контейнер у вигляді циліндра, виконаного у вигляді сітки з полімерною пробкою і отворами для упаковок з біоматеріалом (пластикових соломин), кронштейну, різьбової втулки, гайок та термопари. Проте, використання цього пристрою дозволяє реалізовувати лише фіксовану швидкість заморожування 0,3°С/хв. для ембріонів ВРХ, що виключає можливість вибору оптимальних режимів кріоконсервації для інших типів біооб'єктів, швидкості охолодження яких відрізняються (для ембріонів кроля 1°С/хв., для сперматозоїдів бугая - 10°С/хв. та ін.). Відома також установка для заморожування біологічних об'єктів [Пат. №60161 А Україна, МПК 7 F25D3/10. Установка для заморожування біологічних об'єктів та спосіб ініціації кристалоутворення в кріозахисному середовищі/ Горбунов Л.В., Кабачний В.І., Антоненко Т.С., Горбунова Н.І., Томаровська Т.О./заявка №2003021337. Заявл. 14.02.2003. Опубл. 15.09.2003, Бюл. №9, 2003], що складається с посудини Дьюара та термоблоку, причому останній містить циліндричний корпус з нержавіючої сталі, диск з отворами для розміщення упаковок з біоматеріалом, обмежувальні пластини для підтримування зазначених упаковок, які жорстко з'єднані з диском за допомогою стрижнів з нержавіючої сталі. У відомій установці передбачена фіксація термоблоку на заданій глибині у посудини Дьюара за допомогою з'єднаної з диском порожнистої втулки з різьбленням, через яку у рідкий азот може бути занурений стрижень для ініціації кристалоутворення у кріозахисному середовищі. Крім того, корпус термоблока можна вертикально переміщувати відносно диска. Всередині корпусу передбачені штирі для фіксації корпусу у певному положенні. Термоблок містить термодатчик у вигляді термопари або терморезистора. Для забезпечення різних режимів охолодження передбачена також наявність зйомного дна у термоблока відомої установки. Але використання цього пристрою не дозволяє заморожувати суспензії клітин об'ємом більш ніж 0,2 мл внаслідок великого градієнту температури (приблизно 2°С/мм), який в ньому спостерігається у процесі заморожування. За допомогою даного пристрою можливо проводити кріоконсервацію середовища, що утримує біооб'єкт, тільки у контейнерах у вигляді пластикових соломин та пробірок Уленгута, що виключає можливість кріоконсервувати крім ооцитів та ембріонів ссавців інші види біооб'єктів, такі як суспензії клітин та тканини тварин і рослин наприклад: еякулят риби об'ємом 0,5-^2,5 мл; черешки, меріс 1^ о> 6417 темальні тканини, насіння та пилок рослин. Завданням корисної моделі є створення пристрою для кріоконсервації біологічних об'єктів тваринного та рослинного походження, в якому завдяки новому конструктивному рішенню термоблоку, знижується градієнт температури у пристрої до 1 °С/мм, забезпечується зміна швидкостей заморожування в діапазоні від 0,1 до 52°С/хв., що дозволяє реалізувати оптимальні режими заморожування, крім того новий пристрій дозволяє використовувати різні за конструкцією та розмірами контейнери для біооб'єктів. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у пристрої для кріоконсервації біологічних об'єктів тваринного та рослинного походження, що складається з посудини Дьюара та термоблоку, установленого у її горловині з можливістю зміни глибини занурення відносно верхнього краю горловини посудини Дьюара, причому термоблок містить диск, що утримує ємність для розміщення контейнерів з біооб'єктами, термодатчик та металевий циліндричний корпус, виконаний з можливістю вертикального переміщення та фіксації відносно диска, додатково передбачено, що ємність для розміщення контейнерів з біооб'єктами виконана у вигляді суцільного циліндричного металевого, наприклад мідного, стакану жорстко з'єднаного з диском за допомогою металевих стрижнів, а термодатчик закріплений на внутрішньому боці металевого стакану. Технічна суть і принцип дії запропонованого пристрою пояснюється кресленням, на якому: Фіг.1 - схема пристрою для кріоконсервації біологічних об'єктів тваринного та рослинного походження; Фіг.2 - схема термоблока пристрою для кріоконсервації біологічних об'єктів тваринного та рослинного походження. Пристрій складається з посудини Дьюара 1, термоблоку 2, який в свою чергу містить диск 3 з крипіжними стрижнями 4, ємність 5 для розміщення контейнерів з біоматеріалом 6, металевий корпус 7, термодатчик 8. Кріплення термоблоку 2 у горловині посудини Дьюара 1 здійснено за допомогою стояка 9, з'єднаного з нарізною втулкою 10, прикріпленого до диску 3. Фіксація глибини занурення термоблоку 2 відносно верхнього краю горловини посудини Дьюара 1 досягається за допомогою кріпильної гайки 11. Ємність 5 для розміщення контейнерів з біоматеріалом 6 виконана у формі суцільного металевого стакану циліндричної форми, виготовлено, наприклад, з міді. Фіксація металевого циліндричного корпусу 7 відносно ємності 5 забезпечується, наприклад, штирем 12. Використання заявленого пристрою здійснюється наступним чином. Перший варіант. Біоматеріал у вигляді клітин, бруньок, черенків, тощо розміщують у контейнері 6, які поміщають у ємність 5. В якості контейнерів можуть бути застосовані конверти з алюмінієвої фольги та поліетилену, соломинки Уленгута, тощо. Швидкість охолодження контейнерів залежить від розташування корпусу відносно стакана Н=0 -- (I* 1)см (1=75 - висота циліндричного корпусу), а кінцева температура заморожування - від глибини занурення термоблоку L у горловину посудини Дьюара відносно його верхнього рівня (Фіг.1). Н та L задаються за попередньо визначеними режимами заморожування у залежності від виду біооб'єкта. Величина Н регулю ється за допомогою кріпильної гайки 11, a L - за допомогою штиря 12. З зануренням термоблоку 2 у посудину Дьюара на задану глибину досягаються необхідні швидкість та кінцева температура охолодження біооб'єкту, після чого термоблок 2 занурюють у рідкий азот для зберігання протягом заданого часу. Другий варіант. Контейнери з біоматеріалом 6 помішують у попередньо охолоджений термоблок 2. Для попереднього охолодження термоблока його розташовують на глибині L для досягнення необхідної кінцевої температури. Розташування ємності 5 відносно металевого корпусу 7 та занурення термоблоку 2 відносно горловини посудини Дьюара задається, як у першому способі. Режим попереднього охолодження термоблока триває від 0 до 90 хв., що залежить від заданої швидкості охолодження. Потім в охолоджений таким чином термоблок розміщують контейнери з біоматеріалом та витримують за часом, який необхідний для збезводнення біооб'єкта. Після досягнення необхідної кінцевої температури у контейнерах, їх переносять до рідкого азоту. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. Як варіант пристрій для кріоконсервації біологічних об'єктів тваринного та рослинного походження складається з посудини Дьюара Х-34А (з об'ємом 35 л та внутрішнім діаметром горловини 6 см). При необхідності транспортування, або при проведенні заморожування у польових умовах доцільно використовувати посудину Дьюара Х-5 (з об'ємом 5 л та внутрішнім діаметром горловини 6 см). Стакан термоблоку висотою 5см виготовлено з міді. Товщина стінок стакану складає 0,5 см. Використання мідного стакану забезпечує градієнт температури 0,1°С/мм. Як контейнери для біоматеріалу використовуються конверти з поліетилену або алюмінієвої фольги, пластикові соломини та кріотюбики. Корпус термоблоку представлено пустотілим циліндром висотою 15 см, виготовленим з нержавіючої сталі, корпус відносно стакану може перемішуватися як вверх, так і вниз з фіксацією у потрібному положенні. При переміщенні корпусу відносно стакану на кожний сантиметр різниця температур між мідним стаканом і корпусом змінюється приблизно на 5°С, завдяки чому змінюється швидкість остигання мідного стакану. При опусканні корпусу відносно стакану швидкість остигання зростає, і, навпаки. Відтворювання режиму заморожування та точність визначення кінцевої температури охолодження біооб'єктів визначаються розкидом розподілу температури у горловині посудини Дьюара Х-34А, що становить ±2,5°С, тобто суттєво не залежить від ступеня заповнення посудини азотом, змін навколишньої температури та атмосферного тиску за умов відповідності вимогам, що пред'являються до лабораторних приміщень та паспортних даних посудин Дьюара. Розкид температури щодо середньої величини в посудині Х-5 (при імітації умов транспортування) складає ±5°С. Для визначення можливостей запропонованого пристрою емпірично проведено підбір режимів заморожування на зразках розчину гліцерину. Конверти об'ємом V=2,5 мл поміщають у термоблок з різним розташуванням корпусу відносно мідного стакану, який занурювали на різні глибини у горловину посудини Дьюара Х-34А. Швидкість заморожування змінюється в залежності від ступеня тепловідводу металевого стакану, що забезпечується різним розташуванням відносно 6417 нього циліндричного корпусу термоблоку. Для реалізації низьких швидкостей заморожування відвід тепла від мідного стакану здійснюється завдяки піднятості циліндричного корпусу вверх. Величина Н при цьому має знак "+". Якщо відвід тепла від мідного стакану здійснюється завдяки опусканню корпусу вниз, то величина Н має знак "-". Для кожної швидкості заморожування В та кінце вої температури охолодження Тк величини Н і L визначались експериментально. Оскільки режим охолодження термоблоку реалізується за експоненційною залежністю, то швидкість заморожування визначали за формулою середньозваженого значення у температурному діапазоні від 0 °С до кінцевої температури заморожування. Дані експерименту наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Залежність швидкості заморожування (В, °С/хв.) від глибини занурення термоблоку (L, см) у посудину Дьюара і розташування корпусу термоблоку відносно стакана (Н, см) при різній кінцевій температурі охолодження (Тк, °С) для розчинів гліцерину у конвертах з поліетилену Кінцева температура охолодження Тк, °С 5±1 -15±3 -30±5 -70±5 Швидкості заморожування (В, °С/хв) при різному розташ\/ванні циліндра (Н, см) і різній глибини занурення (L, см) Н=-10 Н=+3 Н=-5 Н=0 L, см В, °С/хв В, °С/хв. L, см В, °С/хв В, °С/хв L, см L, см 0,9 4,2 5,1 0,5 5,2 0,6 4,8 0,1 4,9 9,5 5,5 7,0 8,8 0,1 1,2 3,1 12,4 3,8 0,2 12,9 12,8 2,8 12,5 3,5 0,2 16 30,7 16 15,2 10,2 15,5 20,4 Таким чином, зміна ступеня розташування корпусу термоблока відносно мідного стакану Н (від +3 до -10 см) задає тим самим швидкість охолодження контейнерів з біооб'єктами у широкому діапазоні від 0,1 до 30,7°С/хв. в температурному діапазоні від 20 до -70°С. Приклад 2. Запропонований пристрій дозволяє одержувати різні характери зміни швидкостей заморожування контейнерів з біологічним матеріалом. Для цього термоблок пристрою попередньо охолоджують розташовуючи його на глибині L для досяг нення необхідної кінцевої температури. Режим попереднього охолодження термоблока триває від 0 до 60 хв., що залежить від заданої швидкості заморожування. Потім в охолоджений таким чином термоблок розміщують конверти з поліетилену або фольги, які містять біооб'єкт, тримають протягом кількох хвилин (для збезводнювання клітин), після чого конверти переносять у рідкий азот для зберігання. Використовуючи запропонований пристрій, основні параметри та характеристики якого представлені у прикладі 1, отримали наступні результати (табл. 2). Таблиця 2 Залежність швидкості заморожування (В, °С/хв) від часу попереднього охолодження термоблоку (tn0, хв.) при заданому положенні корпусу термоблока відносно стакана Н=0 см Попередній час охолодження термоблоку tno,*B 0 20 40 60 Середня швидкість заморожування у різних інтервалах температур В, °С/хв +5--15 1,4 8,5 12,4 15,6 Таким чином, використання запропонованого пристрою дозволяє підвищити швидкість заморожування до 52°С/хв., реалізувати різні характери зміни швидкості заморожування. Приклад 3. Запропонований пристрій дозволяє реалізовувати оптимальні режими заморожування різних типів біооб'єктів з використанням посудин Дьюара Х-5, Х-34 та Х-35 у лабораторних та виробничих умовах. За допомогою даного пристрою були кріоконсервовані спермії коропа (Фіг.З, режим а) при оптимальних швидкостях заморожування [Методическое пособие по криоконсервації спермы карпа, лососевых и осетровых видов рыб: Всероссийский научноисследовательский институт прудового рыбного хозяйства. - Москва, 1997. - 10 с ] . Розташування циліндричного корпусу термоблоку відносно мідного стакану відповідало положенню Н=0. Процес заморожування включав наступні етапи: 1) Охолодження термоблоку до +5±2,5°С (це початкова температура кожного режиму заморожування сперми риб) шляхом його занурення в горловину посудини Дьюара Х-5 на глибину І_=2 см. 2) Занурення термоблоку в горловину посудини Інтервал температур, Л Т -15--70 20--5 1,5 10,5 24 9,6 36 14,8 48 16,1 -5 - -70 18 27 38 52 Дьюара на глибину, при якій реалізується кінцева температура охолодження -15±2,5°С. Для кріоконсервації сперми коропа зі швидкістю Ві=1-2°С/хв. глибина занурення термоблока в горловину посудини Дьюара Х-5 складала І_=4,9 см. 3) Занурення термоблоку в горловину посудини Дьюара на глибину, при якій реалізується кінцева температура охолодження -70±2,5°С. Для кріоконсервації сперми коропа зі швидкістю В2=15-20°С/хв. глибина занурення термоблоку в горловину посудини Дьюара Х-5 складала L=15 см. 4) Перенесення упаковок зі спермою у рідкий азот. Рівень збереженості сперміїв коропа при цьому склав 40%, що співпадає з рівнем при використанні існуючих технологій. За допомогою запропонованого пристрою також були кріоконсервовані спермії бугая за наведеними вище етапами зі швидкістю заморожування 30°С/хв. до температури -70±1°С з наступним зануренням у рідкий азот (Фіг.З, режим 6). Оптимальні швидкості заморожування [Харьковская технология асептического взятия и кріоконсервації спермы быковпроизводителей: Методические рекомендации под 8 6417 ред. проф. Ф.И. Осташко - Харьков. - 1990 - 47с] забезпечувались за допомогою термоблока, який розміщений у горловині посудини Дьюара Х-34 на глибині занурення L=16 см. Розташування циліндричного корпусу відносно мідного стакану Н=10. Рівень збереженості деконсервованої сперми склав 50%, що на 10% вище, ніж при заморожуванні на традиційних установках. Приклад 4. Використовуючи запропонований пристрій проведено заморожування черешків черешні зі швидкістю 1°С/годину в діапазоні температур від -5 до -30°С з витримкою біологічного матеріалу при даній кінцевій температурі протягом 48 годин та наступним зануренням у рідкий азот. Розташування циліндричного корпусу відносно мідного стакану відповідало положенню Н=3 см. Оптимальні режими заморожування біооб'єктів реалізовувались з використанням посудини Дьюара Х-35 (з об'ємом 35 л та внутрішнім діаметром горловини 12 см). Завдяки збільшенню внутрішнього діаметра посудини Дьюара у два рази об'єм термоблоку збільшився у чотити рази при тій самій висоті мідного стакану (5 см) та у 8 разів при висоті мідного стакану 10 см. Термоблок занурювали в горловину посудини Дьюара Х-35 на глибину L=11 см. Рівень збереженості деконсервованих черенків склав 28 %, що співпадає з даними, які отримані при заморожуванні за допомогою тра диційних пристроїв jTowill L.E., Forsline P.L. Cryopreservation of sour cherry (Primus cerasus L.) using a dormant vegetative bud method // Cryo-letters. 1999. - Vol. 20. - №4. - P. 215-222]. Таким чином, використання запропонованого пристрою в порівнянні з існуючими має наступні переваги: знижується градієнт температури у пристрої до 1°С/мм завдяки конструктивному виконанню термоблоку, реалізуються оптимальні режими заморожування за рахунок зміни швидкостей заморожування в діапазоні від 0,1 до 52°С/хв.; використання різних за конструкцією та розмірами контейнерів розширює можливості заморожування різних видів біооб'єктів. Вартість виготовлення запропонованого пристрою та самого процесу заморожування для сперміїв тварин у 10 разів нижча, ніж при використанні традиційних технологій, а для ембріонів - подібна до відомих пристроїв. Розроблений пристрій дозволяє одержувати різні характери зміни швидкостей охолодження та проводити заморожування як у лабораторних, так і у виробничих умовах. Варіювання характерного часу теплообміну термоблоку дозволяє використовувати його для заморожування різних типів біооб'єктів: сперміїв ссавців та риб, мерістимальних тканин та черешків рослин, тощо. 12 12 12 Фіг. 2 B-Jfit Фіг. З Комп'ютерна верстка А. Крулевський Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освгги і науки України Державний департамент інтелектуальної' власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ -42,01601