Спосіб корекції функціонального стану лейкоцитів

Винахід стосується галузей біології та медицини та може бути використаний для фармакологічної корекції патологічних станів людини та тварин, що супроводжуються порушенням імунної відповіді. Наряду з імуносупресивними властивостями фармакологічні речовини або не впливають на систему імунітету, або володіють імуностимулюючими ефектами. Відомо про залежність дії фармакологічних речовин від їх дози, що необхідно враховувати при виборі засобів лікування [Забродский П.Ф. Иммуномодулирующие свойства некоторых фармакологических препаратов // Военно-медицинский журнал. - 2000. - №8. - С.66-69]. В теперішній час відомі способи корекції функціонального стану клітин імунної системи за допомогою дексаметазону, глюкокортикоідів [Дранник Г.Н., Гриневич Ю.А., Дизик Г.М. Иммунотропные препараты. - Киев ”Здоров'я”, 1994. - 288с], актиноміцину [Noda N.. Sakagami H., Kokubu F. et all. Iduction of apoptosis m human eosinophilic leukemic cell line (EOL-1) // bit Arch. Allergy Immunol. - 1997. - Vol.144. - P.84-88], ацетилхоліну [Адо А. Д., Федосеева B.A., Камышова В.А. О взаимодействии нейромедиаторных и иммунных рецепторов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1999. - M:.- С. 4-6], а також пептидів природного походження: тактівіну, тімаліну, тімопептину [Хавинсон В.Х., Жуков В.В. Пептиды тимуса и механизмы модуляции // Успехи современной биологии. - 1992. - №4. - С.554-569]. Найбільш близьким до способу, що заявляється є спосіб корекції функціонального стану лейкоцитів периферійної крові з використанням тканинних пептидів [Пат. 48797 А України МПК 7 А61К38/00. Спосіб корекції функціонального стану лімфоцитів периферійної крові. - Кайдашев І.П., Ножинова О.О., Рябенко В.В. Заявл. 14.12.2001; опубл. 15.08.2002; бюл. №8]. Для його здійснення мононуклеарні клітини виділяли з периферійної крові донорів шляхом центрифугування на шарі фікол-верографін. Клітини в концентрації 4-7х106/мл культивували в середовищі RPMI 1640 з додаванням 10% ембріональної сироватки 10мМ HEPES та гентаміцину 100мкг/мл в 96-лунковому планшеті. Пептидний комплекс тимусу - тімалін та поліпептидний комплекс нирок додавали до суспензії клітин в кінцевій концентрації 0,01мкг/мл, 0,1мкг/мл, 0,12мкг/мл, 1мкг/мл, 10мкг/мл та інкубували 24 години при 37°С в вологій атмосфері з 5%СО2. Були досліджені процеси апоптозу лімфоцитів периферійної крові за фізіологічних умов і при модуляції активності їх внутрішньоклітинних регулеторних систем та при станах, що супроводжуються гальмуванням процесів апоптозу. Суттєвим недоліком відомого способу є: 1. Використовуються препарати, які є сумішшю фізіологічно активних речовин і не мають чіткої фармакологічної спрямованості, що ускладнює їх цілеспрямоване застосування. 2. Даний метод не дає можливості дати оцінку корекції функціонального стану поліморфноядерних лейкоцитів (ПМЯЛ). 3. Апоптоз - це загальнобіологічний процес, який визначається за допомогою загальних маркерів апоптозу р53, bc1-2, що ускладнює інтерпретацію результатів. 4. Тривалість методу корекції функціонального стану лейкоцитів. В основу винаходу поставлено завдання створити спосіб корекції функціонального стану лейкоцитів шляхом удосконалення відомого способу, з використанням фармакологічних речовин із специфічною дією у діапазоні їх терапевтичних концентрацій, оцінка їх впливу на експресію манозомістних мембранних структур (МММС) (які приймають участь у функціональної активності лейкоцитів), можливість дати оцінку корекції функціонального стану П МЯЛ, та досягти скорочення часу його визначення. Поставлене завдання вирішують створенням способу корекції функціонального стану лейкоцитів, що включає вплив фізіологічно активних речовин та його оцінку, якій відрізняється тим, що в якості фізіологічне активних речовин використовуються фармакологічні препарати основних медіаторів у діапазоні їх терапевтичних концентрацій, а оцінка проводиться за допомогою визначення експресії МММС. Спосіб здійснюють наступним шляхом. У кров in vitro внести фармакологічну речовину у діапазоні їх терапевтичних концентрацій та інкубувати у вологій камері на предметних стеклах протягом двох годин, відмити еритроцити у 0,01М фосфатному буферному розчині (рн7,4). На фіксовані препарати з прикріпленими лейкоцитами нанести розчин лектину конканаваліну-А (30мкг/мл) (НПК ”Лектинотест”), який має вуглеводн у специфічність до поверхневих глікопротеїдів з моновуглеводним залишком D-манозою. В якості маркеру конканаваліну-А використовувати пероксидазу хрону (30мкг/мл) (”Reanal” Угорщина), яку нанести на препарати на 30 хвилин. Активність пероксидази та відповідно локалізацію пов'язаного з глікокон'югатами конканаваліну-А виявити у розчині, якій містить 0,05% 3,3-діамінобензидіну тетрагідрохлориду (”Chemapol”, Чехія) та 0,015% перекису водню у 0,01 М фосфа тному буферному розчині (рн7,4). Ядра лейкоцитів дофарбовувати 30 секунд у 1% розчині сафраніну (”Chemapol”, Чехія). Ступінь експресії МММС лейкоцитів оцінювати під мікроскопом ”Біолам” за наявністю коричневих відкладень продуктів окисної полімеризації діамінобензидину у вигляді гранул. Обчислювати середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК) окремо для лімфоцитів та ПМЯЛ. Приклад 1: Нами були проведені дослідження корекції функціональної активності лімфоцитів і ПМЯЛ за допомогою інсуліну у концентраціях 1,4х10-3; 2,8 х10-3 і 5,7х10-3ОД/л. Наші дослідження показали, що вплив інсуліну на поверхневі структури лімфоцитів та ПМЯЛ у концентрації 1,4х10-3ОД/л виявив незначні коливання зміни функціонального стану лейкоцитів. А концентрації інсуліну 2,8х10-3 і 5,7х10-3ОД/л призвели до вірогідного підвищення функціонального стану лімфоцитів відповідно на 19% та 31% та на ПМЯЛ відповідно на 53% та 35% (фіг.1). Приклад 2: Корекцію функціонального стану лейкоцитів ізоптином - блокатором кальцієвих каналів - ми проводили у терапевтичних концентраціях 0,12; 0,24 і 0,48мкМ. Було показано, що середня концентрація ізоптину (0,24мкМ) викликала вірогідне підвищення функціонального стану лімфоцитів на 80%, на ПМЯЛ на 75%. Мінімальна та максимальна концентрації ізоптину (0,12 та 0,48мкМ) спричинили інгібування функціонального стану лімфоцитів та ПМЯЛ (фіг.2). Приклад 3: Корекцію функціонального стану лейкоцитів аденозинтрифосфатом - стимулятора пуринергічних рецепторів - ми досліджували у терапевтичних концентраціях 5; 25 і 50нМ. Вплив аденозинтрифосфату на поверхневі стр уктури лімфоцитів викликав дозозалежне посилення експресії МММС відповідно на 38%; 31% і 49,5%, на ПМЯЛ - відповідно на 6%; 12% і 15% (фіг.3). Приклад 4: Корекцію функціонального стану лейкоцитів гістаміном - неселективним активатором гістамінових Н1-, Н2-рецепторів - ми досліджували у терапевтичних концентраціях 39; 58 і 96мкМ. Дослідження показали, що гістамін у мінімальній та середній концентраціях (39 та 58мкМ) вірогідно інгібував функціональну активність експресії МММС лімфоцитів відповідно на 27% та 17%. Максимальна концентрація (96мкМ) викликала незначне підвищення функціональної активності лімфоцитів. На поверхневих структура х ПМЯЛ ми відзначили вірогідне зниження функціональної активності у всіх дослідних концентраціях відповідно на 13%; 12% та 22% (табл.1). Таблиця 1 Вплив гістаміну на експресію манозомістних мембранних структур лімфоцитів та поліморфноядерних лейкоцитів (n=6) Експресія манозомістних мембранних структур На лімфоцитах На ПМЯЛ Внесення 0,9% розчину NaCI Контроль 0,92±0,039 1,44±0,043 Концентрації внесеного гістаміну 39мкМ 0,670±0,6* 1,25±0,02* 58мкМ 0,76±0,01* 1,27±0,02* 96мкМ 1,03±0,077 1,13±0,07* Приклад 5: Корекцію функціонального стану лейкоцитів циметидіном - селективного блокатора гістамінових Н2-рецепторів - ми використали у терапевтичних концентраціях 0,45мкМ; 1,13 і 1,8мМ. Було показано, що блокада гістамінових Н2-рецепторів циметидіном викликала вірогідне зниження функціональної активності лімфоцитів у концентраціях 0,45мкМ та 1,13мМ відповідно на 43% та 15%. Блокада циметидіном гістамінових Н2-рецепторів ПМЯЛ у дослідних концентраціях викликала дозозалежне підвищення їх функціональної активності, де вірогідне підвищення ми спостерігали у концентраціях 1,13 та 1,8мМ відповідно на 17% та 20% (фіг.4). Результати досліджень, проведені запропонованим методом, дозволяють зробити висновок про ефективність застосування фармакологічних препаратів основних медіаторів, таких як інсулін, ізоптин, аденозинтрифосфат, гістамін, циметидін, при корекції функціонального стану лімфоцитів та П МЯЛ.