Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter 3 підвищити синтез поверхнево-активних речовин у 1,8-2 рази і знизити у 4 рази вміст мінеральних компонентів у середовищі. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus 1MB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO47H2O - 0,1; FeSO47H2O 0,001 pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують етанол у концентрації 2% (об'ємна частка). На початку стаціонарної фази росту у середовище одночасно вносять 0,01-0,02% фумарату і цитрату натрію. Фумарат і цитрат вносять у середовище у вигляді 10%-них розчинів натрієвих солей. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0 % етанолу. Кількість інокуляту - 5% від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв..) при 28°С упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 1,8-2 рази концентрацію синтезованих ПАР і знизити у 4 рази вміст мінеральних компонентів у середовищі культивування. Приклад 1. Вплив фумарату і цитрату на синтез ПАР за умов росту R. erythropolis 1MB Ас-5017 і A. calcoaceticus 1MB В-7241 на етанолі Культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): КН2РО4 - 6,8; NaOH - 1,0; NH4NO3 - 0,6; MgSO47H2O - 0,4; СаСl22Н2О - 0,1; FeSO47H2O - 0,001; рН 6,8-7,0. Культивування A. calcoaceticus 1MB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; КН2РО4 - 0,14; MgSO47H2O - 0,1; FeSO47H2O - 0,001 рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол і гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis 1MB Ас-5017 І A. calcoaceticus 1MB В-7241 з середини експоненційної фази, вирощену на рідкому середовищі з 1,0% (об'ємна частка) етанолу чи гексадекану . Кількість посівного матеріалу становить 5% від об'єму середовища. На початку стаціонарної фази росту у середовище вносять фумарат натрію у концентрації 0,2% і цитрат натрію у концентрації 0,1 %. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10%-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв..) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Поверхневий натяг (  s) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C 65960 4 LAUD А (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник «умовної концентрації ПАР» (ПАР*, безрозмірні одиниці). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності as від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці І виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСІ, воронку закривають пришліфованим корком І струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Як видно з наведених у табл. 1 даних, ефективність від внесення у середовище культивування штаму A. calcoaceticus 1MB В-7241 фумарату і цитрату у концентрації 0,2 і 0,1 % відповідно є значно нижчою порівняно зі штамом R. erythropolis 1MB Ас-5017. Так, за присутності органічних кислот у середовищі з етанолом кількість синтезованих R. erythropolis 1MB Ас-5017 ПАР підвищується у два рази (з 0,94 до 1,9 г/л), а синтезованих A. calcoaceticus 1MB В-7241 - лише в 1,3 рази. Ці дані засвідчують необхідність встановлення оптимальних для штаму 1MB В-7241 концентрацій фумарату і цитрату. 5 65960 6 Таблиця 1 Синтез ПАР R. erythropolis 1MB Ас-5017 і A, calcoaceticus 1MB В-7241 на етанолі за присутності органічних кислот Штам Концентрація органічних кислот, % 0 (субстрат - етанол) Цитрат, 0,1 + Фумарат, 0,2 (субстрат етанол) R. erythropolis 1MB Ас-5017 (найближчий аналог) 0 (субстрат - гексадекан) Цитрат, 0,1 + Фумарат, 0,2 (субстрат гексадекан) 0 A. calcoaceticus 1MB В7241 Цитрат, 0,1 + Фумарат, 0,2 Враховуючи, що за досліджуваних концентрацій органічних кислот показники синтезу ПАР A. calcoaceticus 1MB В-7241 підвищуються незначно, а концентрація попередників біосинтезу (чи індукторів), зазвичай не перевищує 10 % концентрації основного джерела вуглецевого живлення, у наступних експериментах концентрацію фумарату і цитрату знижували. Приклад 2. Визначення оптимальної концентрації фумарату і цитрату у середовищі культивування A calcoaceticus 1MB В-7241 Культивування A. calcoaceticus 1MB В-7241 здійснюють як описано у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом вносять фумарат і цитрат у концентрації 0,01 ПАР* 3,4±0,17 ПАР, г/л 0,94±0,04 5,1±0,25 1,90±0,09 3,4±0,17 1,5±0,07 6,6±0,30 2,5±0,12 4,0±0,20 4,3±0,21 1,7±0,08 2,2±0,11 0,2%. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10 %-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв..) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Синтез ПАР оцінюють за показником умовної концентрації поверхнево-активних речовин, який визначають як описано у прикладі 1. Дані, наведені у табл. 2, показують, що з підвищенням концентрації фумарату і цитрату показник умовної концентрації ПАР знижується. Найвищі значення ПАР* спостерігаються у разі виростання органічних кислот в концентрації 0,010,03 %. Таблиця 2 Вплив концентрації фумарату і цитрату на синтез ПАР A. calcoaceticus 1MB В-7241 Концентрація фумарату, % Концентрація цитрату, % ПАР* 0,01 0,02 0,03 0,06 0,08 0,10 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,01 0,02 0,03 0,06 0,08 0,10 0,12 0 5,3±0,26 5,9±0,29 5,0±0,25 4,8±0,24 4,7±0,23 4,2±0,21 4,2±0,21 5,2±0,.26 5,8±0,29 5,1±0,25 4,4±0,22 4,3±0,21 4,2±0,21 4,2±0,21 4,0±0,20 Приклад 3. Синтез ПАР A. calcoaceticus 1MB В-7241 за одночасного внесення у середовище з етанолом фумарату і цитрату Культивування A. calcoaceticus 1MB В-7241 здійснюють як описано у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом одночасно вносять фумарат і цитрат у концентрації 0,01-0,03%. Цитрат натрію і фумарат натрію добавляють у середовище у вигляді 10%-них розчинів. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв..) при 30°С, рН 6,8-7,0 упродовж 120 год. Синтез ПАР оцінюють за кількістю ПАР, яку визначають ваговим методом після екстракції поверхнево-активних речовин сумішшю хлороформу з метанолом (2:1) як описано у прикладі 1. 7 65960 Як видно з наведених у табл. 3 даних, найбільша концентрація синтезованих поверхневоактивних речовин досягається у разі одночасного 8 внесення у середовище з етанолом фумарату і цитрату у концентрації 0,01-0,02 %. Таблиця 3 Синтез ПАР A. calcoaceticus 1MB В-7241 залежно від концентрації одночасно внесеного фумарату і цитрату Концентрація фумарату, % 0 0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 Концентрація цитрату, % 0 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,02 0,03 0,03 0,03 Таким чином, використання як продуцента ПАР штаму A. calcoaceticus 1MB В-7241 і внесення у середовище з етанолом на початку стаціонарної фази росту 0,01-0,02% фумарату і цитрату дає Комп’ютерна верстка Д. Шеверун ПАР, г/л 1,7±0,08 5,1±0,25 4,8±0,24 3,2±0,16 4,8±0,24 4,6±0,23 3,1±0,15 3,1±0,15 3,0±0,15 2,9±0,14 змогу підвищити синтез поверхнево-активних речовин у 1,8-2 рази і знизити у 4 рази вміст мінеральних компонентів у середовищі порівняно з найближчим аналогом. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601